基于個體的三維多孔材料的血管生成建模

1、*大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文）附件：外文文獻(xiàn)資料與中文翻譯稿中文翻譯稿收集：*大學(xué) *學(xué)院 *基于個體的三維多空材料的血管生成建模摘要：本文提出了一種仿真建?？蚣?，通過多孔組織工程支架研究血管和細(xì)胞的生長。該模型模擬毛細(xì)血管的遷移，并在它被嵌入在活組織中時，通過一個組織工程支架形成單個細(xì)孔的血管網(wǎng)。該模型還描述了血流是如何通過網(wǎng)絡(luò)變化不斷生長。還給出了接種細(xì)胞孔的不同策略是如何影響血管形成程度的結(jié)果。另外做了仿真來比較不同的建模參數(shù)變化的數(shù)值，如孔尺寸，接種入孔的內(nèi)皮細(xì)胞的密度和生長因子從支架進(jìn)入孔的釋放速率的結(jié)果。在本文介紹的建?？蚣軐μ剿鳟a(chǎn)生良好血管化組織工程構(gòu)建的實(shí)驗策略有用的，因此在再生

2、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在重要性。關(guān)鍵詞：基于個體建模 數(shù)學(xué)建模 組織工程 再生醫(yī)學(xué) 血管生成 藥物輸送Individual-based modelling of angiogenesis inside three-dimensional porous biomaterialsAbstract: This paper presents a simulation modelling framework to study the growth of blood vessels and cells through a porous tissue engineering scaffold. The model

3、simulates the migration of capillaries and the formation of a vascular network through a single pore of a tissue engineering scaffoldwhenit is embedded in living tissue. The model also describes how the flow of blood through the network changes as growth proceeds. Results are given for how the diffe

4、rent strategies of seeding the pore with cells affects the extent of vascularisation. Also simulations are made to compare results where the values of different model parameters are varied such as the pore dimensions, the density of endothelial cells seeded into the pore, and the release rate of gro

5、wth factor from the scaffold into the pore. The modelling framework described in this paper is useful for exploring experimental strategies for producing well-vascularised tissue engineered constructs, and is therefore potentially important to the field of regenerative medicine.Keywords: Individual-

6、based model, Mathematical model,Tissue engineering,Regenerative medicine ,Angiogenesis,Drug delivery1.簡介組織工程的目標(biāo)是用人造組織替換患病的和受損的器官，并且它涉及滿足未來社會健康保健需要中起主要作用的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（Langer and Vacanti,1993）。影響這個領(lǐng)域進(jìn)步的主要障礙是對發(fā)展和再生正常器官和組織過程中不同進(jìn)程的一個不完整認(rèn)識和理解，以及如何治理這些過程作為以治療為目的的一條可行之路。迄今，組織工程已成功地制作簡單無血管的組織，如皮膚和軟骨，這對氧氣和其他營養(yǎng)成分在維持

7、其內(nèi)細(xì)胞中被動地擴(kuò)散來說足夠薄。盡管較大的樣品可以通過組織把養(yǎng)分灌注入生物反應(yīng)器來維持體外活力，但是被動的擴(kuò)散限制了這種組織至多幾毫米的厚度。血管生成對維持一塊較大組織的活力（諸如組織工程骨骼移植）來說很有必要，即血管的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入組織工程支架的生長，其被接合到宿主組織和灌注血液（Moon and West，2008；Laschke等人， 2006；Bouhadir and Mooney，2001；Soker等人，2000）。為了獲得成功，血管生成術(shù)必須概括這一過程，因為它涉及到一系列組織體包括發(fā)展（Ribatti等人，2009），傷口愈合（Velnar等人，2009）和癌癥（Carmeliet和

8、Jain，2000；Plate等人，1994）的正常和病態(tài)情況。血管長入組織工程支架方式的關(guān)鍵是支架對細(xì)胞遷移、增殖和分化的影響。通過替代天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的方式，組織工程支架起到了作為組織生長（Lutolf和Hubbell，2005）的指導(dǎo)的作用。細(xì)胞和支架之間的相互作用是復(fù)雜的（Harley等人，2008），并且同時具有細(xì)胞生長滿支架表面的二維生長以及細(xì)胞長滿支架孔的三維生長的特點(diǎn)。各種生長因子通常并入生物材料，以鼓勵細(xì)胞生長和粘附（Sohier等人，2008）。同樣刺激細(xì)胞運(yùn)動性，增殖和分化，支架內(nèi)的生長因子可以被安排來通過促進(jìn)定向細(xì)胞遷移，創(chuàng)建化學(xué)引誘物的空間梯度（Singh等人

9、，2008）。天然組織中的血管生成涉及一系列復(fù)雜的緊密精心策劃的生物物理和生物化學(xué)事件。由于存在于組織的化學(xué)生長因子，由內(nèi)皮細(xì)胞組成的毛細(xì)管芽從已經(jīng)建立的血管中出現(xiàn)。每個芽根據(jù)意味著血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)（Gerhardt等，2003）趨化性梯度的端細(xì)胞，使用位于其質(zhì)膜的受體。端細(xì)胞的背后是同時增殖促進(jìn)芽生長，并遷移形成毛細(xì)血管的腔。血管分支是由新芽從內(nèi)皮細(xì)胞增殖區(qū)域的開始造成的。一個芽的生長必然伴隨著局部蛋白水解的降低和通過遷移內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM）的重塑。ECM提供對血管的結(jié)構(gòu)支撐并且還用作為一個刺激血管生成的生長因子（Li等人，2003）的蓄水池。如果毛細(xì)管尖端遇到另一

10、個毛細(xì)管，他們可能融合和他們的腔能夠連在一起，這種現(xiàn)象稱為融合。融合和血管分支一起引起的增長，通過該毛細(xì)管網(wǎng)，血液能夠流動來輸送養(yǎng)分到組織中并除去廢物。支柱細(xì)胞（例如周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）與穩(wěn)定新形成的血管和通過毛細(xì)管網(wǎng)調(diào)節(jié)的血液的流量關(guān)聯(lián)。圖1：（a）圖是以w，d，l為形狀參數(shù)（單位為微米）的虛擬孔的原理圖，（b）圖是嵌在活體組織內(nèi)的虛擬孔陣列示意圖（毛細(xì)血管從動脈和靜脈遷移到孔的入口，動脈和靜脈分別以亮色和深色標(biāo)示出），（c）圖是從上面看一個ADTC5細(xì)胞嵌入快速成型孔隙內(nèi)纖維蛋白凝膠的陣列熒光圖像（亮色為細(xì)胞，比例尺為1毫米）。盡管許多涉及血管生成、血管生成的數(shù)學(xué)和計算建模的復(fù)雜機(jī)制，

11、被證明是對洞察癌癥生物學(xué)（Anderson和Chaplain，1998）和組織工程有價值（Landman和Cai，2007；Jabbarzadeh 和Abrams，2007）。本文提出一種進(jìn)入組織工程支架的血管生長理論調(diào)查，其目的是確定改善血管形成的實(shí)驗方案（Jain等人，2005； Nomi等人，2002），包括種子細(xì)胞的分布和密度，支架孔的尺寸和生長因子進(jìn)入支架的合并。為了達(dá)到這個，一個仿真建模被設(shè)計用來研究細(xì)胞生長成虛擬細(xì)孔（參照圖1的(a)）。當(dāng)它們遷移到的多孔組織工程支架常見的類型，包括那些使用超臨界流體的方法生產(chǎn)（Barry等人，2004年）和用圓形成孔劑的鹽鑄造和溶劑瀝濾（Mur

12、phy等人，2002），這樣的孔會遇到細(xì)胞。最近，這樣一組由聚合物制成、使用快速原型制作技術(shù)的陣列孔（參照圖1的(b)）已用于研究長入支架的絨毛尿囊膜的生長（(Lemon等人，在報道里），另外，在圖1的(c)中，快速原型排列的孔與嵌入纖維蛋白凝膠的ADTC5細(xì)胞一起接種在毛孔內(nèi)。 圖2：在模擬結(jié)束時使用不同的接種策略的孔隙組織的外觀。策略A和C中成纖維細(xì)胞最初放置在虛擬孔的頂部，而在B和D中，他們是分散在整個凝膠各處。在策略C中內(nèi)皮細(xì)胞分散在凝膠中，而在D中成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)通過孔隙分布。血管的顏色表示血流速度的大小。顏色亮的點(diǎn)表明成纖維細(xì)胞的位置。尺寸為微米。本文涉及四種植入到生物

13、體組織虛擬細(xì)孔（見圖2A-D）的不同情況。虛擬孔可以被認(rèn)為作為許多這樣可通往虛擬支架的表面的孔之一（參照圖1的(b)）。之所以假定孔隙填滿有纖維蛋白凝塊，具有凝膠屬性，是因為當(dāng)所述支架被手術(shù)植入時，血液流進(jìn)孔隙（Rouwkema等人2008；van Hinsbergh等人，2001）。此外，細(xì)胞接種到支架中，要么深入孔中，這種情況時，細(xì)胞在孔的上端形成單一層（在場景A和C），要么均勻地分布在整個孔（在場景B和D）。在所有四種情況中，作為成纖維細(xì)胞的種子細(xì)胞，分泌透過血纖維蛋白凝膠擴(kuò)散的生長因子并鼓勵從下方進(jìn)入孔的血管生成。不同方案的仿真結(jié)果比較可以揭示如何不同接種策略可影響孔隙的血管形成的最終

14、程度。圖2中C和D展現(xiàn)了一種以加速形成血管網(wǎng)為目的的前血管形成策略（Unger等人，2007）。圖2的C描繪了類似的場景A中除了接種內(nèi)皮細(xì)胞均勻過孔的情況。圖2描述情景B對應(yīng)的除了共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的孔接種（Levenberg等人，2005）。 本文提出了一種理論研究，給出了采用毛細(xì)管和細(xì)胞通過虛擬孔生長的基于個體建模的四種不同策略。本文的其余部分的結(jié)構(gòu)如下。第2節(jié)詳細(xì)地描述了不同的仿真規(guī)則。然后在第3節(jié)給出探索不同的接種策略和建模參數(shù)值是如何影響的血管長入毛孔的程度和速度的模擬結(jié)果。第4節(jié)討論并總結(jié)。2.仿真建模該建模規(guī)定更新個人毛細(xì)管尖端和成纖維細(xì)胞點(diǎn)的規(guī)則：他們通過孔遷移和增殖

15、。假定頂端細(xì)胞遷移和增殖的同時發(fā)生會引起立即形成永久血管內(nèi)皮細(xì)胞的痕跡。2.1細(xì)胞遷移的一般規(guī)則所有毛細(xì)管頂端細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的點(diǎn)在t-0時刻的時間增量t時被同時更新。細(xì)胞在三維空間固定網(wǎng)格中以柵格間距h=10m移動，表示所采取細(xì)胞或毛細(xì)管的直徑。占據(jù)孔隙表面的一個泡孔直徑范圍內(nèi)點(diǎn)的細(xì)胞被認(rèn)為是與表面接觸的（也見2.5節(jié)）。鑒于細(xì)胞移出當(dāng)前點(diǎn)（用整數(shù)標(biāo)簽i編入索引），在每次迭代的量pij被分配給的假定的概率時，細(xì)胞（無論是毛細(xì)管尖端或成纖維細(xì)胞）將移動到任意的26中最近的一個鄰近點(diǎn)（以整數(shù)標(biāo)簽j索引），其中jpij=1。影響細(xì)胞運(yùn)動的方向選擇的三個因素是趨化性，持久性和隨機(jī)運(yùn)動性。首先，為了模

16、擬趨化性，一個固定的概率，p×,chem0，分配到網(wǎng)格方向最接近的化學(xué)引誘物的梯度方向,n=u/ |u|，其中u是如在第2.6節(jié)描述的計算出的生長因子的濃度。為了模擬細(xì)胞運(yùn)動在給定方向的持續(xù)傾向，概率pij=p×,bias，分配給相同的方向上，細(xì)胞最后一次移動，其中0<p×,chem+p×,bias<1。然后，隨機(jī)運(yùn)動性包括通過分配剩余的24個相鄰的網(wǎng)格點(diǎn)被選中的等概率，即pij=(1-p×,chem-p×,bias)/24。在下標(biāo)中“×”表示細(xì)胞類型：要么是毛細(xì)管的“帽子”或是成纖維細(xì)胞的“纖維”?？梢宰C明的是

17、:如果pij保持不變，細(xì)胞以在剩余相同網(wǎng)格點(diǎn)的零概率通暢隨機(jī)游走，細(xì)胞的平均遷移速度為jpijdij/t，其中dij為點(diǎn)i和點(diǎn)j在柵格中的距離。為了獲得想要的平均遷移速度c，測量pij，從而細(xì)胞從網(wǎng)格點(diǎn)i到j(luò)移動的絕對概率是pij=pijct/jpijdij,其中t取足夠小，使得pij1。然而，考慮到與接觸孔表面的細(xì)胞相比，通過凝膠遷移的細(xì)胞的遷移速度不同，如果點(diǎn)j位于孔隙表面，則pij的定義不同： (1)其中，是表示通過該孔表面增加或減少細(xì)胞遷移速度的因子參數(shù)。式(1)中的規(guī)模步驟有效地延緩細(xì)胞移動，由此，維持在同一網(wǎng)格點(diǎn)的概率為Pii=1-jPij。0<P<1的隨機(jī)數(shù)從一個均勻

18、分布和27個可能點(diǎn)（包括本位點(diǎn)）中選出，細(xì)胞的下一個點(diǎn)由j=minj|1j27,kjPik>給出。注意，在該建模中，表面細(xì)胞能夠遷移到孔中，而不是表面，即細(xì)胞對于支架的附著是可逆的（Ghibaudo等人，2009）。對于任一類型的細(xì)胞，即毛細(xì)管頂端細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，所選擇的參數(shù)值是這樣的：模擬中的遷移速度在0c×25mh-1范圍中，上限與體外內(nèi)皮細(xì)胞遷移速度相一致（Stokes和Lauffenburger，1991）。模擬時間步驟的值t應(yīng)嚴(yán)格地取盡可能小，以便接近于真實(shí)生物組織連續(xù)時間的生長，從而避免細(xì)胞的同步運(yùn)動。在所給的情況中，選擇t=0.1h以減少模擬時間步驟的總數(shù)，同時

19、不違反式(1)中Pij1的條件。2.2.頂端細(xì)胞的移動的規(guī)則參數(shù)值pcap,chem=0.6和pcap,bias=0.3被選為表征趨化性和血管生長的隨機(jī)行為（另參見第2.4節(jié)）。根據(jù)第2.1節(jié)設(shè)定的規(guī)定計算的Pij，在遷移方向額外限制是強(qiáng)制設(shè)置一些Pij為零。位于點(diǎn)i的頂端細(xì)胞與孔表面接觸，不可以移動到周圍的支架，也不可以通過在z=l處的尖端（參見第2.5節(jié)）離開孔，所以對于j指示支架里面的點(diǎn)或zl處， Pij= 0。在z = 0處，頂端細(xì)胞允許離開孔的入口，但在那種情況下，血管的遷移停止，并且尖端被限制在流量計算中（參見第2.9節(jié)）。為了確保毛細(xì)管在短距離內(nèi)沒有彎折回去，模擬血管中抗彎剛度，

20、在Pij的計算中，只有那些網(wǎng)格方向包括先前傾斜度為90或更少的毛細(xì)管段。如果沒有被成纖維細(xì)胞占據(jù)或所得的毛細(xì)管段將跨越另一個表示已有毛細(xì)管的線段路徑，毛細(xì)管尖端發(fā)展到選取的網(wǎng)格點(diǎn)。如果發(fā)生這樣的障礙物，細(xì)胞被強(qiáng)制保持在同一網(wǎng)格點(diǎn)。2.3毛細(xì)血管生長，分支和接合的規(guī)則據(jù)推測，生長因子最小濃度uthr可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖。為了模擬這一情況，頂端細(xì)胞的毛細(xì)管速度對生長因子濃度ui的依賴性ccap被選擇為： (2)假定毛細(xì)管分支在移植血管的端部以毛細(xì)管每單位長度的平均值為rbr隨機(jī)發(fā)生的圖。在實(shí)驗中，已知血管密度會隨VEGF濃度的增加而增加（Lund等人，2000），在建模中，這是通過使rbr表

21、示成ui的分段線性遞增函數(shù)實(shí)現(xiàn)： rbrui=0 rbr,satui-uthrusat-uthr rbr,sat 如果ui<uthr， 如果uthrui<usat，如果uiusat。 (3)假定分支率為式（2）用到的相同閾值濃度的零下，在模擬中Jabbarzadeh和Abrams(2007)取分支率uthr=10ngml-1，在其濃度與模擬中生長因子最大濃度一致時達(dá)到飽和，usat=1ngml-1（參照第3節(jié)中圖3(a)）。毛細(xì)管分支的飽和速率rbr,sat=10-3h-1，這等于Jabbarzadeh和Abrams等人(2007)使用的提及尖端細(xì)胞點(diǎn)的值，10-4h-1m-1（即

22、對允許沿血管全長分支的研究）。按照載于第2.1節(jié)中的規(guī)則，如果點(diǎn)i處的頂端細(xì)胞移動到點(diǎn)j，產(chǎn)生一個我隨機(jī)數(shù)0<<1。如果<rbrdij,創(chuàng)建一個新的頂端細(xì)胞。新血管起源于點(diǎn)i，并選擇其遷移方向的規(guī)則和載于第2.1節(jié)的規(guī)則一樣。但是采取允許方向可以通過新的支路限制在垂直于先前和當(dāng)前親本分支的毛細(xì)管段。當(dāng)毛細(xì)管尖端移動到先前有毛細(xì)血管的柵格點(diǎn)，兩個血管的接合和腔連接在一起。圖3：(a)圖是模擬后沿孔的軸線測量的生長因子u濃度，分別為對于不同孔隙尺寸的接種策略A和對于生長因子從支架不同釋放速率的接種策略B，(b)圖是對于固定的外部直徑d300m，不同收縮直徑w時接種策略B的血管化和

23、血管化速率R。誤差線標(biāo)示五種模擬的方法和標(biāo)準(zhǔn)差。2.4規(guī)則遷移的成纖維細(xì)胞和增殖為了模擬成纖維細(xì)胞的增生，如果一個隨機(jī)數(shù)是從滿足<rdivt的均勻分布中選出，其中rdiv是成纖維細(xì)胞分裂的速度，則在每一時間步長，就產(chǎn)生新的成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞分裂時，新創(chuàng)建的細(xì)胞放置在那些隨機(jī)選擇的未被占據(jù)的相鄰網(wǎng)格點(diǎn)（如果所有相鄰點(diǎn)都被占據(jù)，則分裂不會發(fā)生）。這樣做的結(jié)果是，稀疏分布的細(xì)胞數(shù)目將在時間內(nèi)以速率常數(shù)rdiv的指數(shù)級增加。用成纖維細(xì)胞接種到血纖維蛋白凝膠的倍增時間T2×7天（Cox等人，2004），決定了數(shù)值rdiv=ln2/T2×=4.13×10-3h-1。如果

24、分裂不發(fā)生，成纖維細(xì)胞允許根據(jù)2.1節(jié)中描述的規(guī)則來遷移。設(shè)pij為零，以防止成纖維細(xì)胞遷移進(jìn)入該支架或流出在z = 0或1的孔。如果所選擇的點(diǎn)已被另一個頂端細(xì)胞占據(jù)，則成纖維細(xì)胞不遷移，成纖維細(xì)胞或血管（因此高細(xì)胞密度將導(dǎo)致接觸抑制效果，即細(xì)胞遷移將減慢）。據(jù)假設(shè)，成纖維細(xì)胞對生長因子沒有趨化反應(yīng)，所以在模擬中pfibr，chem=0。pfibr，bias和cfibr的值來源于膠原凝膠中成纖維細(xì)胞的遷移數(shù)據(jù)（Shreiber等人，2001），其中細(xì)胞運(yùn)動性（擴(kuò)散）系數(shù)D=0.45m2min-1，引用到的持續(xù)時間（細(xì)胞改變方向的平均時間）=2.5h。用這些值和由公式cfibr=6D/得到的cf

25、ibr5.7hm-1（參見Celis的例子，2006年，第385頁）來估計成纖維細(xì)胞的速度。持續(xù)性偏置參數(shù)的值可以根據(jù)在第2.1節(jié)中描述的公式從持續(xù)時間來估計，通過注意細(xì)胞移動到鄰近網(wǎng)格點(diǎn)的速率為c×/jpijdij，因此它的轉(zhuǎn)向率為1-p×,biasc×/jpijdij。為簡單起見，考慮長度為h的細(xì)胞移動的唯一方向，持續(xù)時間與轉(zhuǎn)向率=hc×-11-p×,bias-1相反。用這個公式計算出pfibr,bias=0.3，而且還可以使用Stokes和Lauffenburger（1991）闡明的細(xì)胞遷移的持續(xù)時間ccap,pore=5mh-1和=3h

26、，推導(dǎo)出 pcap,bias= 0.3。2.5虛擬孔虛擬孔的形狀如圖1所示，近似由兩個半球狀的孔接合而成的收縮物。雖然表現(xiàn)這一特征的數(shù)據(jù)可以用微計算機(jī)層析成像，從真實(shí)組織工程支架中而獲得，但是當(dāng)前情況下，僅僅只考慮到了一種簡化數(shù)學(xué)表述?？椎谋砻嬉詧A柱極坐標(biāo)r=rsz表示，0<2和0zl，其中rsz=12d1+121-wdcos2zl-1 (4)式(4)中，w為z=l/2處頸縮的直徑，d為z=0和l處孔的外徑，l為孔的長度?？椎某叽缰付ǖ膮?shù)如圖1所示。親本血管位于z<0的區(qū)域，在該區(qū)域毛細(xì)血管萌芽，進(jìn)入宿主組織?？椎那鎟=rsz和該孔的頂部z=l被視為是遷移的障礙，從而細(xì)胞可以在

27、r<rsz和0z<l的區(qū)域內(nèi)的任何點(diǎn)。假設(shè)占據(jù)支架表面半個細(xì)胞直徑點(diǎn)的細(xì)胞，即rsz-r1/2h，與支架接觸。還假設(shè)孔的頂部提供一種連接物表面，因此軸向坐標(biāo)z的細(xì)胞，例如l-z1/2h，也與支架接觸。2.6生長因子成纖維細(xì)胞能分泌生成血管的生長因子而為人所熟識，包括VEGF（Martin等人，2004），它促使毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的形成（Kunz-Schughart等人，2006）。因此，在建模中，假定血管生成為由單個具有VEGF的化學(xué)特性的生長因子驅(qū)動，其通過凝膠擴(kuò)散，而蛋白質(zhì)以恒定速率降解，（Chen等，2007）并被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化（Scott和Mellor，2009）。為了模擬這些過程，

28、通過位于網(wǎng)格點(diǎn)的點(diǎn)源和點(diǎn)匯求解擴(kuò)散方程，以確定在孔隙內(nèi)的任意點(diǎn)的點(diǎn)r=x,y,z的生長因子濃度u，采用Jabbarzadeh和Abrams（2007）的類似方法： (5)其中數(shù)量D是生長因子的擴(kuò)散系數(shù)，ks是成纖維細(xì)胞的分泌速率，ku是內(nèi)皮細(xì)胞的攝取速率，kd是凝膠中的生長因子的降解速率。符號是梯度矢量，r是狄拉克函數(shù)。生長因子的分泌，降解和攝取都被視為是式（5）中的點(diǎn)匯，以避免不同類型的組織在離散中的重疊，但是用柵格立方的量h3，測量點(diǎn)匯關(guān)系，以反映在柵格立方體中一致發(fā)生的降解和吸收。擴(kuò)散系數(shù)允許隨著點(diǎn)變化；它在孔中任意點(diǎn)是非零常數(shù)，用D=Du，但在支架內(nèi)為零，以便執(zhí)行邊界條件（見下）。 值

29、Du=7.0×10-11m2s-1，kd=0.83h-1取自纖維蛋白凝膠中VEGF的實(shí)驗量化擴(kuò)散（Chen等，2007），且該值ks=2.69×10-5pgcell-1h-1取自Stefanini等人（2008），其值相當(dāng)于該研究中健康組織細(xì)胞的VEGF的每秒0.1摩爾細(xì)胞（0.1 molecules cells-1）的釋放速率。緊隨Bauer等人（2007年），值ku=1h-1已被用于內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的吸收速度，但是u的增加速度沒有飽和，包含在該研究中所用的模擬中。為了模擬涉及摻入生長因子的支架的實(shí)驗（Peters等，2002），生長因子釋放的恒定速率以邊界條件得以應(yīng)用D

30、unu=- (6)應(yīng)用在支架表面，其中是生長因子的釋放速率，n是孔表面的一端指向內(nèi)部的單位法線。據(jù)推測，生長因子無法通過該孔的頂部和底部離開，因此邊界條件nu=0， (7)在z=0和l處強(qiáng)制實(shí)施。在z=l處無通量邊界條件可以被認(rèn)為是由以X=Y=0和z=l為中心的圓形孔陣列組成的，厚度為2l的虛擬支架中心的對稱條件。在每次仿真開始使用的初始條件ur，0=0 (8)根據(jù)式(6)和式(7)給出的邊界條件，以及式(8)給定的初始條件，用差分法來求解式(5)。詳細(xì)細(xì)節(jié)可以在附錄中找到。已知VEGF對頂端細(xì)胞的遷移方向有較強(qiáng)的趨化作用（Gerhardt等人，2003），因此使用有限差分逼近計算被頂端細(xì)胞占

31、據(jù)的網(wǎng)格點(diǎn)的u，就如第2.1節(jié)所述的用來確定血管遷移方向的方法。2.7細(xì)胞孔隙的接種在策略A和策略C中，接種的孔起初有一層成纖維細(xì)胞覆蓋該孔z=l處的頂部?；诋?dāng)d=100m時，有20個成纖維細(xì)胞，以外直徑d特定的值接種入孔的成纖維細(xì)胞的數(shù)目nfibr，可以假定孔頂部細(xì)胞的表面密度恒定算出。因此nfibr取為最接近20d/100m2的整數(shù)。對于策略B和D，其中成纖維細(xì)胞均勻地接種在孔中，nfibr以同樣的方式算出。孔中成纖維細(xì)胞的體積密度就是sfibr=nfibr/Vpore，其中孔的體積由下式給出 (9)(也見式(13)）。在這項研究中使用的參數(shù)值sfibr106mL-1這相當(dāng)于成纖維細(xì)胞接

32、種到血纖維蛋白凝膠的實(shí)驗中使用的接種密度（Brown等人，1993）。策略C和D中，用內(nèi)皮細(xì)胞均勻地接種孔。模擬中，用于內(nèi)皮細(xì)胞的接種密度范圍，scap=0.05-10.0×106mL-1，與使用纖維蛋白凝膠的體外血管生成實(shí)驗的密度范圍相一致，（Martineau和Doillon，2007年）。在模擬中，每個接種內(nèi)皮細(xì)胞假定能立即形成具有功能性管腔的血管，并且其能從阻塞頂端細(xì)胞遷移的兩末端生長。起初兩個頂端細(xì)胞的位置一致。2.8.孔隙和宿主組織之間的相互作用假設(shè)虛擬孔隙為植入相鄰的宿主組織的動脈和靜脈中（參照圖1的(b)）親本血管芽的固定數(shù)量被指定進(jìn)入在z=0處的孔。一旦入口點(diǎn)ux,

33、y,0uthr，芽可以提前進(jìn)入孔隙。假定此后沒有血管進(jìn)一步向內(nèi)生長。假定毛細(xì)管進(jìn)入孔的數(shù)量nspr正比于細(xì)孔入口的面積，這反映了較大的孔將在接觸與更多的親本血管?；?個芽進(jìn)入d =50m細(xì)孔，nspr取最接近于3(d/50m)2的整數(shù)。每個毛細(xì)管隨機(jī)指定為小動脈或小靜脈。毛細(xì)血管進(jìn)入孔隙的入口點(diǎn)被稱為在2.9節(jié)中描述的液體流量計算的“輸入”。2.9.血管形成的分析用于計算通過網(wǎng)絡(luò)的血流和參數(shù)值選擇的方法，與McDougall等（2002年）所采取一致。憑借假定通過毛細(xì)管連接網(wǎng)格點(diǎn)i到鄰近的網(wǎng)格點(diǎn)j的流速Q(mào)ij為服從泊肅葉定律，Qij=R48dij(Pj-Pi)。 (10)在這個等式R=4m是

34、毛細(xì)管腔半徑，=4×103Pa s是有效粘度，dij是毛細(xì)管的長度，其值等于網(wǎng)格點(diǎn)和Pi之間的距離，為在i點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)毛細(xì)管的壓力?；鶢柣舴蚨梢?guī)定，實(shí)際流入每個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的流量為零，因此對于i點(diǎn)處的一個節(jié)點(diǎn)kQik=0, (11)其中求和包括連接至該節(jié)點(diǎn)的所有血管。假設(shè)毛細(xì)管尖端沒有泄漏（其被頂端細(xì)胞封鎖），所以公式(11)對于位于點(diǎn)i的頂端細(xì)胞降低到Qij=0，其中j是唯一對應(yīng)于接合到點(diǎn)i處節(jié)點(diǎn)的其他節(jié)點(diǎn)位置。如果對應(yīng)一個輸入的節(jié)點(diǎn)，相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)壓力被設(shè)置為800帕或0帕，這取決于輸入是小動脈還是小靜脈。等式(10)和(11)中，給定輸入節(jié)點(diǎn)指定的壓力，定義一組用于血管分支和網(wǎng)絡(luò)的輸入節(jié)

35、點(diǎn)處的節(jié)點(diǎn)壓力的線性方程。求解這些方程，以確定整個毛細(xì)血管網(wǎng)的Pi和Qij。為了評估血管網(wǎng)絡(luò)提供養(yǎng)分進(jìn)入細(xì)孔的深度，數(shù)量，灌注密度，C被定義為Cz=2nR(z)QdlV(z)， (12)其中的線積分是由所有軸向位移大于z的毛細(xì)管組成的路徑。注意到對于完全處于z內(nèi)的部分，對線積分的貢獻(xiàn)是Qijdij。在公式（12）中，n是一個通用溶解在毛細(xì)管內(nèi)流體的養(yǎng)分濃度，而數(shù)量V（z）為z和l之間孔隙的體積，其為 (13)灌注密度表示忽略養(yǎng)分被細(xì)胞的任何吸收，養(yǎng)分輸送到軸向位移z和l之間部分孔的速率。為了比較多套不同參數(shù)值的模擬結(jié)果，這有益于劃分z=0，i，e處C(z)。C(z)=C(z)C（0）, (14

36、)然而，在接下來光標(biāo)將被丟棄，C是由由式（14）給出的標(biāo)準(zhǔn)值。另外一個單獨(dú)標(biāo)量，血管形成V，表明整個毛孔血管，定義為=0lC(z)dz. (15)該模擬將一直進(jìn)行，直到所有血管吻合，或直到最大時間t=Tend=300h過去，到那時的灌注密度和血管形成是足夠接近所有血管吻合術(shù)的穩(wěn)態(tài)值。為了獲得到達(dá)這一穩(wěn)態(tài)時間的方法，在離散時間，tn，每個模擬中每個tn=5h時都計算出來，以及該值被用來計算Tvasc=tnTendtnTendTend-(tn). (16)根據(jù)這個定義0TvascTend，以及Tvasc的值越小，達(dá)到其最終值的時間越短。此外，血管形成的速度R被定義為R=TendTvasc, (17

37、)這指示該孔成為血管的平均速率。血管形成和血管形成的速率一起表明細(xì)胞被接種到孔隙后如何可能存活下來。的值越大，營養(yǎng)素可以輸送到的孔隙越深，以及的值越大，這些營養(yǎng)素以最大速率傳遞的時間越短，這意味著因為缺乏營養(yǎng)而丟失的細(xì)胞越少。3.結(jié)果編碼第2章中描述的規(guī)則的計算機(jī)程序是用Fortran 95，并基于Linux的PC上運(yùn)行。使用MATLAB電腦包制作圖形輸出。模擬中使用的參數(shù)值見表1。描繪模擬結(jié)尾處孔隙內(nèi)部組織的外觀的模擬結(jié)果示于圖2A D中的四種不同類型的接種。成纖維細(xì)胞分泌通過孔擴(kuò)散的生長因子，其降解和吸收帶來的生長因子的濃度梯度漸變，這直接影響毛細(xì)血管的生長。吻合引起血管腔的互連網(wǎng)絡(luò)的形成

38、，基于孔隙，通過該網(wǎng)絡(luò)血液從輸入流到動脈和靜脈。圖2中血管的顏色越淺，流過它的血液流速越大。因此血液的最大流率的地方接近底部，其中液體在輸入之間取短路徑。對于策略A和C的成纖維細(xì)胞(t=0時在孔的頂端以層狀排列)遷移和增殖，以便通過該孔的上半部分分散。在策略A和C中，血管的遷移方向是比較直的，因為他們要通過縮頸，但當(dāng)它們進(jìn)入被細(xì)胞占據(jù)的孔區(qū)域就變得更雜亂無章。圖3(a)展現(xiàn)出對不同接種策略，不同孔隙形狀參數(shù)值w和d，以及支架生長因子不同的釋放速率的模擬結(jié)束的孔隙內(nèi)部的生長因子的濃度分布曲線。在所有情況下，取速率比為=5的2D / 3D遷移。該曲線通過測繪生長因子的濃度，u，作為z的函數(shù)沿著該孔

39、的中心線，也就是其中x=y=0。生長因子曲線如圖3(a)所示，接種策略A中，有以w = 100微米的收縮孔和以w=300米的圓柱形孔，這兩種孔的外徑均為d=300微米，當(dāng)=0的情況時，生長因子由位于孔上半部分的成纖維細(xì)胞分泌，當(dāng)其被毛細(xì)管降解并吸收時，生長因子通過該孔擴(kuò)散。這使得生長因子的濃度產(chǎn)生梯度變化，使u變成z的增函數(shù)。圖3(a)顯示出減少w影響是增加縮頸附近的濃度梯度u的幅度。圖3(a)還展現(xiàn)了使用和不使用從支架表面釋放的生長因子，w=100和d=300接種策略B的生長因子剖面。因為這一策略中，成纖維細(xì)胞通過凝膠均勻地接種，與策略A相比，生長因子剖面更加均勻。對于包括從支架釋放出的生長

40、因子=20的情況，生長因子曲線的平均濃度更大，但是還有通過孔隙比=0情況更大的縱向濃度梯度。此濃度梯度是由從被血管占據(jù)的支架分泌的生長因子，和孔的收縮形狀增大造成的。因此，當(dāng)>0時，血管可以通過孔隙進(jìn)一步生長，因為成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子濃度橫向梯度對遷移的方向影響較小。生長因子在時間刻度l2/Du4h時通過整個細(xì)孔擴(kuò)散，這意味著移植后在z=0處需要花幾個小時使u累積達(dá)到該閾值水平uthr，在此之后，血管開始遷移進(jìn)入孔隙。在細(xì)胞直徑的擴(kuò)散時間要比細(xì)胞維持在同一柵格位置平均時間少得多，即d2/Dud/c×，因此用公式計算(5)計算u之間的差異較小，并且使用相同的方程，但沒有時間導(dǎo)

41、數(shù)，即準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)溶液計算?？梢酝ㄟ^整個孔和孔隙容積劃分的等式(5)兩側(cè)積分，從孔隙內(nèi)生長因子的平均濃度導(dǎo)出一個微分方程。假定生長因子的速率kd通過孔隙均勻地降解，忽略ku和kdD（見表1）之間的細(xì)微不同，它可以證明是如下, (18)其中是生長因子的平均濃度，pore是細(xì)孔表面積與體積比。二項隨時間增加，為成纖維細(xì)胞的增殖，然而由于等式(18)右手側(cè)的第三項在量級上比成纖維細(xì)胞的分裂速度rdiv要大得多，可以近似使用準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)，即uav可用如下公式計算. (19)因此uav持續(xù)增加直到凝膠中所有的空位都填充滿了成纖維細(xì)胞，到那時其增殖停止。圖3（b）展示了對于因收縮直徑w的值不同而變化的接種策略A，對于

42、d=300固定外徑的孔，血管形成和血管形成的速率R。用于2D/3D遷移速度比的值是=5，沒有生長因子從支架釋放，=0。圖表顯示為了盡可能深地輸送養(yǎng)分進(jìn)入孔，w=d=300m的圓柱形孔效果最佳。由此可以看出，而減少，因為吻合掐斷了網(wǎng)絡(luò)的生長，血管被迫通過收縮遷移。另一方面，R隨著w的增大而增大，因為該孔的向內(nèi)彎曲的形狀易于促進(jìn)血管附著于孔表面。這導(dǎo)致血管遷移速度的增加，因為在模擬用了一個大于統(tǒng)一的的值。圖4：(a)圖為對于w=d圓柱孔接種策略A，作為對于不同的值，2D/3D遷移速度比的孔隙直徑的函數(shù)的血管形成，(b)圖為血管化速率R。誤差線標(biāo)示五種模擬的方法和標(biāo)準(zhǔn)差。細(xì)胞附著于組織工程支架的表面

43、的遷移速度取決于其化學(xué)（Kouvroukoglou等人，2000）和機(jī)械性能（Isenberg等人，2009），并且該速度可能和從纖維蛋白膠內(nèi)的細(xì)胞遷移速度不同（Zaman等人，2006；Kniazeva和Putnam，2009）。為了調(diào)查細(xì)胞和支架表面之間的相互作用可能對于內(nèi)向的細(xì)胞遷移和孔的血管形成結(jié)果的影響，以不同的（2D/3D遷移速度比）值進(jìn)行模擬。圖4展現(xiàn)出如何血管形成和血管形成速率R，對于策略A圓筒狀孔值的不同而變化，即以w=d，具有不同直徑且沒有生長因子的釋放=0。當(dāng)=5時，與= 0.2和1相比，可以取得更高和R的值，尤其是對于小直徑的孔。這是因為小直徑孔的表面積與體積之比越大，

44、易于促進(jìn)細(xì)胞和孔表面之間的接觸，其上遷移速度越高。但值得注意的是，因為細(xì)胞更少，誤差帶的尺寸隨孔直徑的減小而增加，因此模擬結(jié)果的隨機(jī)性更大。因為血管形成的增強(qiáng)可以通過附著細(xì)胞的遷移速度最大化獲得，通過本文余下部分，=5的值一直在模擬被使用。圖5：（a）圖是沿孔的軸線采用不同的接種策略的灌注密度C，作為位移z的函數(shù)，（b）圖是對不同的策略的血管形成和血管形成速率R。在（b）中誤差線標(biāo)示五種模擬的方法和標(biāo)準(zhǔn)差。圖5(a)展示出了灌注密度C的曲線，軸向位移z的函數(shù)和四種不同的孔隙接種策略。每條曲線是使用公式(12)-(14)，從圖2中的模擬結(jié)果計算得出的。從式(15)，圖5(a)中曲線底部的面積越大

45、，血管形成越大。圖 5(b)顯示出對于不同接種策略，和血管形成速率R的比較。給出的結(jié)果是孔隙的收縮直徑w=100微米，外直徑d=300微米，=5的2D/3D遷移速率比，并且沒有生長因子從該支架分泌的情況下，= 0。數(shù)字表明，最成功的策略是A和C，這兩個策略都得到了相似的和R的值。策略C得到的R值稍大，因為內(nèi)皮細(xì)胞的接種前期意味著形成完全互相連接的網(wǎng)絡(luò)需要的時間更少。策略B和D沒有得到與A、C一樣大的值，因為成纖維細(xì)胞的均勻分布易于使血管以隨機(jī)方式生長，從而血液易于通過接近孔隙入口的血管分流。對于策略A和C，成纖維細(xì)胞初始的局部接種產(chǎn)生縱向生長因子梯度，包括血管縱向的趨化性和從而輸送血液到更深的

46、孔中。不同策略的相對成功也反映在圖5(a)圖5的曲線中，圖中展現(xiàn)出了與策略B和D模擬展示相比，在策略A和C的情況下，血管形成深度更大。圖6：圖展現(xiàn)了血管形成和血管形成速率R，其中(a)圖為對于生長因子從支架釋放的不同速度的策略B，而(b)圖為對于內(nèi)皮細(xì)胞不同接種密度scap的策略C。誤差線標(biāo)示五種模擬的方法和標(biāo)準(zhǔn)差。圖6展示出了血管形成和血管形成速度R的曲線圖，在策略B中(a)的結(jié)尾生長因子從支架釋放速率，策略C中(b)的內(nèi)皮細(xì)胞接種密度，scap的不同值。給出的結(jié)果是收縮直徑w=100m，外部直徑d=300m和= 5的2D/3D遷移速率比的孔。圖6(a)表明，從支架上的生長因子控釋釋放可以提

47、高策略B中細(xì)孔的血管形成。這發(fā)生是因為梯度向量由支架釋放的生長因子的分量量級，大于由成纖維細(xì)胞的分量量級，所以血管被誘導(dǎo)遷移到遠(yuǎn)離成纖維細(xì)胞，進(jìn)入更深的孔。然而，這個增大影響較大值的穩(wěn)定，并且由于阻礙影響接種細(xì)胞，和R的值小于那些使用策略A獲得的值.然而圖5(b)展示出用策略C，其中該孔是內(nèi)皮細(xì)胞接種前期，是提高血管形成速率的一個成功方法。圖6（b）表現(xiàn)的是R可以通過使用較高的內(nèi)皮細(xì)胞接種密度進(jìn)一步增大。血管形成速率隨著scap增加而增加，因為這易于使血管以更快的速度吻合，從而縮短完成網(wǎng)絡(luò)成長的時間。促進(jìn)孔隙血管形成的策略易于增大生長因子濃度的縱向方向梯度，從而有利于移植血管縱向趨化。這種趨化

48、反應(yīng)的強(qiáng)度由參數(shù)pcap,chem的大小制約，但是尚不清楚在本研究中如何評估可獲得的實(shí)驗數(shù)據(jù)的值。模擬表明，對于策略A和C，減小參數(shù)pcap,chem的值易于血管形成和血管形成R速率的減少。然而，那些取pcap,chem= 0.6獲取的關(guān)于激勵血管形成不同策略的相對功效的總體結(jié)論不變。4.討論本篇論文論述了一個基于個體的用于調(diào)查實(shí)驗性策略的模擬，該策略可以促進(jìn)多孔的生物材料中的血管再生。在模擬中我們發(fā)現(xiàn)策略C效果最好，使血管形成最大化。策略C中，成纖維細(xì)胞被接種在小孔的局部區(qū)域中，內(nèi)皮細(xì)胞均勻地接種在孔隙里。這是因為成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了在生長因子濃度下、縱向進(jìn)入孔隙的梯度，并且與策略A相比，內(nèi)皮細(xì)胞接種前期縮短了網(wǎng)絡(luò)建立的時間。雖然實(shí)驗顯示策略B的血管形成可以通過從支架分泌生長因子進(jìn)入孔隙的方式來提高，但因為成纖維細(xì)胞均勻接種不能創(chuàng)建一個指向小孔的梯度，策略B和D沒有實(shí)現(xiàn)高度血管化?？紤]到實(shí)驗中對單孔尺度可能很難精確處理趨化性梯度，無論是通過局部的細(xì)胞接種，還是通過空間的分級釋放生長因子的速率，生長因子釋放空域不變的策略B可能是最可行的策略。研究發(fā)現(xiàn)直孔相比于收縮孔隙而言能達(dá)到更好的血管化，而且血管化也可以通過最大化連接到支架上的細(xì)胞遷移速度和使