制藥工程專業(yè)微生物實驗講義

1、微生物學實驗（懷化學院微生物學課程組）微生物學實驗室學生要求為了營造一個安全有效、秩序良好的實驗室環(huán)境，達到“科學、規(guī)范、安全、高效”的目的，特對進入微生物學實驗室進行實驗的學生作如下要求。1. 按已分好的班級組次，按時參加實驗，并完成實驗項目。2. 進入實驗室前，要求穿戴整齊，需穿好實驗服，不能穿人字拖類拖鞋進入實驗室。3. 上課前要求上交當堂課程的實驗預習報告。4. 要求獨立或以小組為單位完成實驗項目，實驗期間保持實驗室安靜，不能大聲喧嘩，并及時記錄好實驗數(shù)據(jù)。5. 實驗完成后及時對實驗結(jié)果進行分析并完成實驗報告。6. 實驗完成后需及時清洗實驗器皿，清潔和整理實驗臺，做好衛(wèi)生，保持實驗室干

2、凈整潔。授課教師：劉衛(wèi)今、黎曉英微生物學實驗 序號 實驗項目名稱1實驗一、培養(yǎng)基的制備及滅菌2實驗二、從土壤中分離和純化微生物3實驗三、細菌革蘭氏染色法及芽孢染色法4實驗四、油鏡的使用和細菌形態(tài)的觀察5實驗五、放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)觀察6實驗六、微生物的計數(shù)及大小的測量（以下實驗內(nèi)容僅供參考，具體內(nèi)容以相應教材為準）實驗一 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實驗目的1掌握培養(yǎng)基配制的原理。2通過對牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、 馬鈴薯培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。3解高壓蒸汽滅菌的基本原理及操作方法。二、實驗原理 1什么是培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)基應具備哪些營養(yǎng)要素？2培養(yǎng)基有哪些類型，為

3、什么培養(yǎng)不同的微生物需要的培養(yǎng)基不同，培養(yǎng)基為什么要調(diào)節(jié)pH 值，配制好的培養(yǎng)基為什么要立即滅菌？3高壓蒸汽滅菌的原理是什么？三、實驗材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、鏈霉素、1mol/L NaOH、1mol/L H Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布和玻璃漏斗等。 四、操作步驟(一 )牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。其配方如下:牛肉膏3 g，蛋白胨l0

4、g，NaCl 5 g，瓊脂15-20 g, 水1000 mL，pH 7.47.6 1. 稱量：按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2. 加熱溶解：在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。 3. 調(diào)pH：檢測培養(yǎng)基的pH，若pH

5、偏酸，可滴加1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/LHCl進行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4. 過濾：液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，此步可省略。5. 分裝：披實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積內(nèi)一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜滅菌后垂直

6、待凝。6. 加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法則圖11。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長約35塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。7. 包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應先把試管扎成捆后，再于棉塞外包層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8. 滅菌：將上述培養(yǎng)基于1213濕熱滅菌20min。如因特殊情況沒能及時滅菌，

7、則應放人冰箱內(nèi)暫時保存。9. 擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜面長度不超過試管總長的一半。10. 無菌檢查。將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)24-48h，無菌生長時可以使用，或放置在冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。 圖1-1 棉塞的制作過程(二)高氏1號培養(yǎng)基的配制高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgS04·7H2O 0.5g ，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂1520g, 水1000mI，pH 7.2-

8、7.4。1. 稱量和溶解：經(jīng)計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放人小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。對微量成分FeSO4.7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O，配成濃度為0.01gmL的貯備液，再在1000ml培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白臟培養(yǎng)基配制。2. pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查，與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法同。(三)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

9、的配制 馬鈴薯培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：馬鈴薯200g，葡萄糖（或蔗糖）10g，瓊脂15-20g，水1000mI，自然pH。1. 稱量和溶解。馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30min（注意火力的控制，可適當補水），用紗布過濾，濾液加糖，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制，補足水至所需的總體積。2. 分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋自胨培養(yǎng)基配制。3. 鏈霉素的加入。鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化后待溫度降全45左右時才能加入。可先將鏈霉素配成1的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于-20)，在1000mL培養(yǎng)基中加1鏈霉素0.3mL，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈

10、霉素30ug。注意事項:稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋：調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。(四)高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌。1. 加水。將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為宜。2. 裝料。將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以免冷凝水沾濕棉塞。3. 加壓。將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時旋緊相對的兩個螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開排氣閥。 4. 排氣。用電爐或煤氣加熱，待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣

11、孔排出. 一般排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內(nèi)空氣已排凈(沸后約5min)。5. 升壓。當鍋內(nèi)空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。本實驗用121，20min滅菌。 7. 降壓。達到所需滅菌時間后，關閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開排氣閥，放凈余下的蒸汽后，再打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。 8. 無菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基于37培養(yǎng)24h，無雜菌生長，即可待用。五、問題和思考 1. 配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么? 2. 培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理？如何進行無菌檢查， 3. 試設計實驗對飲料進行無菌檢查。 實驗二

12、從土壤中分離和純化微生物一、實驗目的1學習從土壤中分離微生物的方法，學習無菌操作技術(shù)；2掌握微生物樣品稀釋法和涂布平板法分離微生物的操作技術(shù)；3初步掌握無菌操作技術(shù)和平板菌落計數(shù)法。二、實驗原理1. 什么是微生物的純培養(yǎng),從固體培養(yǎng)基中分離微生物的方法有哪些?2. 為什么可以根據(jù)菌落數(shù)目來計算樣品中微生物的數(shù)量?三、實驗材料和用具土壤樣品：有目的地取某一類型的土壤。培養(yǎng)基：已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基，90mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶、100無菌水、無菌試管、10酚液、1%鏈霉素。無菌培養(yǎng)皿12套、5mL和1mL的無菌移液、天平、稱量紙、藥勺、試管架、涂布器。四、操作步驟(一)土

13、壤稀釋分離 1. 取土壤。取表層以下510cm處的土樣，放入滅菌的袋中備用，或放在4冰箱中暫存。2. 制備稀釋液(1) 制備土壤懸液：稱土樣10g，迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中(90mL)，振蕩20min使土樣充分打散，即成為10-1的土壤懸液。(2) 稀釋：用無菌移液管吸10-1的土壤懸液0.5mL放入4.5mL無菌水中即為10-2稀釋液，如此重復，可依次制成10-3一10-8的稀釋液(圖2-1)。注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以減少稀釋中的誤差。圖2-1 稀釋法分離土壤微生物操作過程圖解3稀

14、釋倒平板法測定菌落數(shù)的方法(1) 將培養(yǎng)基加熱熔化，冷至5560，在高氏1號培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，在馬鈴薯培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液至終濃度為30ug/mL，混勻后倒入平板。倒平板時要注意無菌操作，見圖3-2。 圖2-1 倒平板的方法(2)取土壤稀釋液高氏一號培養(yǎng)平板：取10-3、10-4 兩管稀釋液各0.1mL分別接人相應標號的含該種培養(yǎng)表面的中央；PDA培養(yǎng)平板：取10-3、10-4兩管稀釋液各0.1mL，分別接人相應標號的平皿中；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板：取10-6、10-7、10-8三管稀釋液各0.1mL，分別接人相應標號的平皿中；(3) 涂布：玻璃涂棒滅菌后，十字涂布（演示），靜置5-1

15、0min。4培養(yǎng)：將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，細菌于237恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)12d；放線菌和霉菌28培養(yǎng)，分別培養(yǎng)57d或 35d，可用于觀察菌落，用于進一步分離純化或直接轉(zhuǎn)接斜面。 五、注意事項 1. 一般土壤中，細菌最多，放線菌及霉菌次之而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤個分離細菌時，要取較高的稀釋度，否則菌落達成一片不能計數(shù)。 2. 在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計數(shù)準確。 3. 放線菌的培養(yǎng)時間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當增多。 六、實驗報告1. 記錄土壤稀釋分離結(jié)果，并計算出每克土壤中的細菌、放線菌和霉菌的數(shù)量。計算方法：

16、選擇長出菌落數(shù)30一300之間的培養(yǎng)皿進行計數(shù), 按以下公式： 總菌數(shù)g同一稀釋度幾次重復的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù) 七、問題和思考1試設計實驗，從土壤中分離出酵母菌并進行計數(shù)。 實驗三 細菌革蘭氏染色法及芽孢染色法一、實驗目的1. 初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟；2. 掌握細菌芽孢染色的方法。 二、 實驗原理1. 觀察微生物細胞時，為什么要對微生物進行染色?2. 革蘭氏染色的機理是什么？3. 芽胞染色的機理是什么？三、實驗材料和用具Escherichia coli、Staphylococcus aureus培養(yǎng)24 h菌落平板， Bacillus thuringiensis培養(yǎng)

17、24 h的斜面菌種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、復紅液和5孔雀綠水溶液。 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈和燒杯。 四、操作步驟(一) 革蘭氏染色 1涂菌：用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2. 干燥：于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3固定：目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法即將細菌涂片向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止茵體燒焦、變形。此制片可用于染色。4. 初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染

18、1min后，用水洗去剩余染料。5. 媒染：滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。6. 脫色：滴加95乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30s至1min水洗。7. 復染：滴加復紅液復染1min，水洗。8用濾紙吸干，油鏡鏡檢。 (二)芽孢染色法 1方法1 (1) 取37培養(yǎng)18-24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見“細胞單染色法”) 。(2) 于載片上滴人35滴5孔雀綠水溶液。(3) 用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時開始計算時間約4-5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4) 傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀

19、綠不再褪色為止。(5) 用堿性復紅復染1min，水洗。(6) 制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。 2方法2 (1) 加1-2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分期勻打散，制成濃稠的菌液。 (2) 加5孔雀綠水溶液23滴于小試管中用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。 (3) 將此試管浸干沸水浴(燒杯)中，加熱1520min。 (4) 用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。 (5) 水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為比。 (6) 加沙黃水溶液，染23min后，傾去染液，不用水洗。(7) 干燥后

20、用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。(三) 結(jié)果 革蘭氏陽性菌染成藍紫色, 革蘭氏陽性菌染成淡紅色。 五、注意事項 1涂片務求均勻切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。 3脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌。 4老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。 5供芽孢染色用的菌種應控制菌齡，使大部分芽泡仍保留在菌體上為宜。六、問題和思考 1涂片后為什么要進行固定，固定時應注意什么? 2. 什么是革蘭氏染色法?染色過程應注意什么? 3. 試分析革蘭氏染色法在細菌分類中的意義。 4. 為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?實驗四 油鏡的使用和

21、細菌形態(tài)的觀察一、 實驗目的1. 掌握顯微鏡油鏡使用的方法。2. 初步掌握微生物學繪圖方法。二、實驗原理1. 顯微鏡油鏡為什么能增加照明亮度?2. 為什么能增加分辨率？三、實驗材料和用具乙醚和乙醇混合液（7：3）、Escherichia coli涂片、 Staphylococcus aureus涂片， Bacillus thuringiensis染色裝片、香柏油、顯微鏡、擦鏡紙 。 四、操作步驟(一) 觀察前的準備 1將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4cm。坐正，練習用左眼觀察。2調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動反光鏡采

22、集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察未染色裝片時，光線不宜太強。 3. 低倍鏡觀察染色裝片 首先下降載物臺，將染色裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，將觀察位置移至低倍鏡的物鏡正下方。從側(cè)面觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器上升載物臺，適當縮小光圈，然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡臺緩慢下降至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。4. 高倍鏡觀察 旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與破片相撞。再用目鏡觀察，仔細調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細調(diào)節(jié)器校正焦距

23、使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部分移至視野中心。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。5. 油鏡觀察 從側(cè)面注視，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡和油鏡位于光源上方兩側(cè)，八字岔開。在玻片標本的鏡檢部位滴香柏油。 旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，使油鏡轉(zhuǎn)至正下方，浸在油中。 將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用細調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。（二）細菌形態(tài)的觀察1. 觀察細菌的基本形態(tài) 用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察革蘭氏染色的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，芽胞染色的蘇云金桿菌，并分別在油鏡下繪圖。五、注意事項 1注意擦鏡頭時，只能用擦鏡紙。2觀察完畢，必須將下降載物臺，才能取下裝片放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作不能在油鏡下直接取下和

24、替換裝片，切記。3無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。六、實驗報告（一)繪圖 給出你所觀察到的幾種細菌的個體形態(tài)視野圖。 繪出你所觀察到的細菌細胞結(jié)構(gòu)視野圖，并注明各部分。 （二)試指出在制備活菌裝片時，應注意什么問題? 七、問題和思考1. 用明視野顯微鏡觀察細菌的形態(tài)時，你認為用染色裝片好還是用非染色裝片好？觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同? 2. 無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么? 3. 試設一個準備該實驗的工作方案。 實驗五 放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)觀察一、實驗目的1了解放線菌、酵母菌、霉菌的培養(yǎng)方法。2掌握放線菌、酵母菌、霉菌的制片技術(shù)和

25、染色方法。3掌握觀察放線菌、酵母菌、霉菌的形態(tài)特征的方法。二、實驗原理1. 放線菌、霉菌和酵母菌在形態(tài)特征和生殖方式上有什么異同?2. 如何鑒別酵母菌細胞的活性?3. 用乳酸石碳酸棉蘭染色液對霉菌制片有哪些優(yōu)點?三、實驗材料和用具Streptomyces sp.（鏈霉菌 ）,Saccharomyces cerevisiae （釀酒酵母 ）， Penicillum citrinum （桔青霉）,Rhizopus oryzae （米根霉），Aspergillus niger(黑曲霉)。酵母菌染色液：呂氏堿性美藍染液。霉菌染色液：乳酸石碳酸棉蘭染色液顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精

26、等。四、操作步驟放線菌制片與觀察。1. 插片法培養(yǎng)放線菌。按無菌操作要求，取鏈霉菌培養(yǎng)物在高氏一號培養(yǎng)基上密集劃線接種。用鑷子取無菌載片以45。角插入培養(yǎng)基平板上。將平板倒置，于28培養(yǎng)35天。2. 用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的放線菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。霉菌的形態(tài)觀察1霉菌培養(yǎng)：按無菌操作方式將霉菌點接于在PDA培養(yǎng)基平板上，于28 培養(yǎng)35天。2. 直接制片觀察法：滴一滴乳酸石碳酸棉蘭染液于載片上，用鑷子取霉菌培養(yǎng)物少許

27、，先于50%乙醇中浸一下先去脫落的孢子，然后將培養(yǎng)物置于染液中，用大頭針小心將菌絲分開。加蓋玻片。3霉菌觀察：先用低倍鏡觀察菌體的各個部位，認識霉菌各部分結(jié)構(gòu)，必要時用高倍鏡觀察，尤其注意觀察產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)以及根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。繪圖并標明各部分名稱。酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定1以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。2. 取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色23min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細

28、胞(藍色)與活細胞(不著色)。3. 在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)56個視野。酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表示，以下式來計算：死亡率=死細胞總數(shù)死活細胞總數(shù)×100%五、注意事項1用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤；在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率；通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。2培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染。3玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，六、實驗報告1. 繪出放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；2. 計算酵母菌的死亡率；3根霉、曲霉和

29、青霉形態(tài)圖，示各部結(jié)構(gòu)。七、問題和思考1. 試比較細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)的差異？      2在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?實驗六 微生物顯微計數(shù)和大小測量一、實驗目的 1掌握使用測微尺和血細胞計數(shù)板測定微生物的數(shù)量 2鞏固顯微鏡的使用方法。二、實驗原理1測量微生物數(shù)量的方法有哪些?2為什么可用血細胞計數(shù)板來測量微生物的數(shù)量？血細胞計數(shù)板由四條平行槽構(gòu)成 3個平臺，中間的平臺較窄，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺面各有一個含 9 個大格的方格網(wǎng)，中間大格為計數(shù)室。計數(shù)室的長和寬各為l mm，中間平臺下陷 0

30、.01 mm，故蓋上蓋玻片后計數(shù)室的總?cè)莘e為 0.1 mm3。血細胞計數(shù)板的構(gòu)造見圖 16. 常見血細胞計數(shù)板的計數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是 16x 25 型，稱為麥氏血細胞計數(shù)板共有 16個小格，每個小格分為 25 個小格。另一種是 25x16 型，稱為希里格式血細胞計數(shù)板，共有 25 個中格，每個中格又分成 16 個小格。但是不管哪種規(guī)格的血細胞計板其計數(shù)室的小格均由 400 個小方格組成。應用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計算微生物細胞的數(shù)量，方法是先測定若干個方格中的微生物細胞，再換算成每 m1 菌液(或每 g 樣品)中微生物細胞數(shù)量。 圖6-1 血細胞計數(shù)板顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接

31、物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份(圖 151B)。目鏡測微尺每格實際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡 的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進行標定。鏡臺測微尺為專用中央有精確等分線的載玻片(圖 151A)，一般將長為 1mm的直線等分 100個小格，每格長 0.01mm, 即 10um，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。3. 為什么可用測微尺測定微生物大??？ 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份(如下圖)。目鏡測微尺每格實際代表的長度

32、隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進行標定。鏡臺測微尺為專用中央有精確等分線的載玻片(如下圖)，一般將長為 1mm的直線等分 100個小格，每格長 0.01mm, 即 10um，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。例如，目鏡測微尺 20 個小格等于鏡臺測微尺 3 個小格，已知鏡臺測微尺每格為 10um，則 3 小格的長度為 3×1030um，那么相應地在目鏡測微尺上每小格長度為 3X10÷201.5(um)。用以上計算方法分別校正低倍鏡,高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。三、實驗材料和用具 Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）、生理鹽水、美藍染色液、顯微鏡、血細胞計數(shù)板、擦鏡紙、蓋玻片、無菌試管、電吹風機、目鏡測微尺、鏡臺測微尺等。三、操作步驟 （一）酵母菌的顯微鏡計數(shù) 1 菌懸液制備：將5 mL的生理鹽水加到釀酒酵母的斜面培養(yǎng)物上，用接種環(huán)刮取菌苔，將菌懸液倒入盛有5 mL的生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩使細胞分散。2 找計數(shù)室和檢查血細胞計數(shù)板：先在低倍鏡下尋找計數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉(zhuǎn)換高倍鏡后，調(diào)節(jié)光亮度至計數(shù)室線條清晰為止。在顯微鏡下檢查計數(shù)室，若有污物，用自來水沖洗，再用95%