第1講--細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施與技術(shù)基礎(chǔ)(1)

1、臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柳滿然柳滿然E-mail: mliu-Tel: 6848-5184細(xì)胞工程原理細(xì)胞工程原理1精選ppt任課老師任課老師-柳滿然簡(jiǎn)介柳滿然簡(jiǎn)介1988、1991、2002分別于湖南師大、山東大學(xué)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部獲得學(xué)士、碩士、博士學(xué)位2003-2008留學(xué)美國(guó)、助理研究員主要研究領(lǐng)域：（1）腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移（2）腫瘤EMT轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移、血管形成（3）miRNA與腫瘤早期診斷2009-重慶醫(yī)科大學(xué)，博士生導(dǎo)師2精選ppt任課老師任課老師-柳滿然簡(jiǎn)介柳滿然簡(jiǎn)介目前在研課題8項(xiàng)：國(guó)家自然科學(xué)基金3項(xiàng) 教育部博士點(diǎn)基金1項(xiàng) 教育部出國(guó)留

2、學(xué)基金1項(xiàng) 重慶市科委科學(xué)基金1項(xiàng) 校重點(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng) 優(yōu)秀歸國(guó)人員啟動(dòng)基金1項(xiàng) 完成國(guó)家自然科學(xué)基金主任基金1項(xiàng)3精選ppto理論：36學(xué)時(shí)，1,2,3,4,6,8,10,12,13周o實(shí)驗(yàn)：18學(xué)時(shí)， 5,7,9,11周o理論課老師：張伶(柳滿然)，陳婷梅， 柳滿然o實(shí)驗(yàn)課老師：陳婷梅，柳滿然教學(xué)安排4精選ppt細(xì)胞工程細(xì)胞工程 (Cell engineering)*按一定設(shè)計(jì)方案，在細(xì)胞、亞細(xì)胞或組織水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，獲得重構(gòu)的細(xì)胞、組織、器官及個(gè)體，創(chuàng)造優(yōu)良品種和產(chǎn)品的生物工程。緒論與課程介紹緒論與課程介紹 P1-4細(xì)胞生物學(xué)、生物工程是其基礎(chǔ)5精選ppt細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容*l 細(xì)胞與組

3、織培養(yǎng)細(xì)胞與組織培養(yǎng)(Cell/Tissue culture)(P1)l 細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交(Cell fusion/hybridization)： 在自然或人工誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞在自然或人工誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞 形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程 運(yùn)用：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)運(yùn)用：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)l 細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植(Nuclear transplantation)：利用顯微操作：利用顯微操作 技術(shù)，將胞質(zhì)與胞核分離，再將不同來(lái)源的胞質(zhì)與胞核技術(shù)，將胞質(zhì)與胞核分離，再將不同來(lái)源的胞質(zhì)與胞核 重組，形成一個(gè)新的雜合細(xì)胞重組，形成一個(gè)新的雜合細(xì)胞緒論與課程介紹

4、緒論與課程介紹 P1-46精選ppt細(xì)胞工程的范疇l 染色體工程染色體工程(Chromosome engineering)： 將單個(gè)染色體、染色體組轉(zhuǎn)入或移出目的細(xì)胞，使目的將單個(gè)染色體、染色體組轉(zhuǎn)入或移出目的細(xì)胞，使目的 細(xì)胞的染色體組發(fā)生變化細(xì)胞的染色體組發(fā)生變化l 胚胎工程胚胎工程(Embryonic engineering)： 以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對(duì)象，進(jìn)行的細(xì)胞工程操作以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對(duì)象，進(jìn)行的細(xì)胞工程操作 運(yùn)用：畜牧業(yè)運(yùn)用：畜牧業(yè)緒論與課程介紹緒論與課程介紹 P1-47精選ppt細(xì)胞工程的范疇l 干細(xì)胞與組織工程干細(xì)胞與組織工程(Tissue engineering)：

5、將干細(xì)胞與材料科學(xué)相結(jié)合，將自體或異體干細(xì)胞經(jīng)體外將干細(xì)胞與材料科學(xué)相結(jié)合，將自體或異體干細(xì)胞經(jīng)體外 擴(kuò)增后，種植在預(yù)先構(gòu)建好的聚合物支架上，在適宜條件擴(kuò)增后，種植在預(yù)先構(gòu)建好的聚合物支架上，在適宜條件 干細(xì)胞沿聚合物支架遷移、鋪展、生長(zhǎng)、分化，最終發(fā)育干細(xì)胞沿聚合物支架遷移、鋪展、生長(zhǎng)、分化，最終發(fā)育 為具有特定形態(tài)和功能的工程組織。為具有特定形態(tài)和功能的工程組織。 l 轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器(P2)： 緒論與課程介紹緒論與課程介紹 P1-48精選ppt緒論與課程介紹緒論與課程介紹 P1-4細(xì)胞工程發(fā)展的細(xì)胞工程發(fā)展的4個(gè)基本階段個(gè)基本階段 P3-4細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞融

6、合細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因生物9精選ppt“細(xì)胞生物學(xué)”與“細(xì)胞工程”的區(qū)別？n細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 是研究細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律及其機(jī)制的基礎(chǔ)性學(xué)科 研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容： 在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能、表型及其調(diào)控機(jī)制； 著重細(xì)胞活動(dòng)的精細(xì)分子調(diào)節(jié)機(jī)制及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究 n細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)：一級(jí)學(xué)科n細(xì)胞工程細(xì)胞工程：二級(jí)學(xué)科10精選ppt主要以細(xì)胞為對(duì)象，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性生物技術(shù)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程(Cell engineering)11精選pptu前沿性：現(xiàn)代生物技術(shù)的熱點(diǎn)u綜合性：多學(xué)科交叉u應(yīng)用性：工程類課程，重在產(chǎn)品與技術(shù)u爭(zhēng)議性：新技術(shù)給倫理

7、道德帶來(lái)的沖擊細(xì)胞工程特點(diǎn)細(xì)胞工程特點(diǎn)12精選ppto發(fā)酵工程o酶工程o基因工程o細(xì)胞工程細(xì)胞工程o組織工程o蛋白質(zhì)工程o代謝工程細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物工程技術(shù)中最具有現(xiàn)代性和生命力的組成部分，細(xì)胞工程課程在生物工程與生物技術(shù)人才培養(yǎng)中具有重要的作用。該課程是生物工程、生物技術(shù)專業(yè)的核心課程之一?，F(xiàn)代生物工程現(xiàn)代生物工程13精選ppt1997年多莉羊口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、及干擾素、凝血因子和、生長(zhǎng)激素、免疫球蛋白以及單克隆抗體等。 2001年人耳鼠動(dòng)物細(xì)胞工程的成果動(dòng)物細(xì)胞工程的成果14第一章第一章 細(xì)胞工程的設(shè)施與技術(shù)基礎(chǔ)細(xì)胞工程的設(shè)施與技術(shù)基礎(chǔ)u 細(xì)胞培養(yǎng)的

8、設(shè)施和儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施和儀器設(shè)備u 細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)的條件u無(wú)菌操作基礎(chǔ)無(wú)菌操作基礎(chǔ)-清洗與消毒清洗與消毒15第一節(jié)第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施和儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施和儀器設(shè)備16精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施和儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施和儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與要求： 嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境 無(wú)微生物污染 不受其它有害因素的影響細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則：無(wú)菌操作室最好單獨(dú)設(shè)置，設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè) 常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室 培養(yǎng)、儲(chǔ)存位于中間清洗、消毒在另一側(cè)17精選ppt18精選pptl無(wú)菌操作室l培養(yǎng)室l制備室：通常是單獨(dú)的，對(duì)無(wú)菌的要求不如上述嚴(yán)格，培養(yǎng)基等的制備l清洗室：器皿等清洗l消毒滅菌室l儲(chǔ)藏室

9、：液氮罐、冰箱、培養(yǎng)基、消毒后培養(yǎng)器皿常于一室，即常稱的細(xì)胞培養(yǎng)室動(dòng)物工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及六項(xiàng)工作室19精選ppt常用儀器與設(shè)備（常用儀器與設(shè)備（P9）濾器，酸缸超凈工作臺(tái)CO2培養(yǎng)箱顯微操作儀、倒置顯微鏡液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀冰箱培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板離心設(shè)備：離心機(jī)、離心管、移液管/吸管/移液器搖床水純化裝置壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱細(xì)胞計(jì)數(shù)器/儀、計(jì)數(shù)板20精選ppt工作原理利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣濾過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒而凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 超凈超凈工作工作臺(tái)臺(tái)21精選ppto超凈工作臺(tái)：也稱凈化工作臺(tái) （形成氣流屏障）。o常見類

10、型（P9） 側(cè)流式（垂直式，吸氣型） 外流式（水平層流式，面向操作者流動(dòng)，吹氣型）超凈超凈工作工作臺(tái)臺(tái)22精選ppto側(cè)流式超凈工作臺(tái)23精選ppt24精選ppto無(wú)菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。o操作間放置：超凈工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。o緩沖間放置：電冰箱、冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等。實(shí)驗(yàn)室布局實(shí)驗(yàn)室布局25精選ppt26精選pptn CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2n 使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微 松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒 （90，14hrs)。 箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫

11、升蒸餾水槽中以 保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱27精選ppt二氧化碳培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱 28精選ppt二氧化碳培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu)二氧化碳培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu)29精選ppt大容量細(xì)胞培養(yǎng)箱大容量細(xì)胞培養(yǎng)箱細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)30精選ppt倒置顯微鏡倒置顯微鏡31精選ppt自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀純水裝置純水裝置32精選ppt過(guò)濾裝置過(guò)濾裝置-過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌各種培養(yǎng)用液只能用過(guò)濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。微孔濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾裝置33精選ppt液氮容器冰箱冰箱與液氮罐冰箱與液氮罐34精選ppt壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器35精選ppt壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器36精選ppt移液器移液器3

12、7精選ppt常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板38精選ppt1個(gè)10cm培養(yǎng)皿 = 2.5個(gè)6cm培養(yǎng)皿1個(gè)6cm培養(yǎng)皿 = 2個(gè)3cm培養(yǎng)皿1個(gè)3cm培養(yǎng)皿 = 1個(gè)6孔板1個(gè)6孔板 = 2-2.5個(gè)12孔板 = 4-6個(gè)24孔板經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)39精選ppt生物安全的責(zé)任和義務(wù) 保證培養(yǎng)物不受污染，更要保證培養(yǎng)物不對(duì)人和環(huán)境造成 污染和危害 從事致病性微生物實(shí)驗(yàn)的科研、教學(xué)、生產(chǎn)單位，實(shí)驗(yàn)室 必須有防止致病性微生物擴(kuò)散的制度和人體防衛(wèi)措施實(shí)驗(yàn)室的生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全(補(bǔ)充補(bǔ)充)40精選ppt 據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或

13、人群的危害程度分為4類： 一類：引起非常嚴(yán)重疾病的微生物實(shí)驗(yàn)室的生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全病原微生物的分類病原微生物的分類 二類：引起嚴(yán)重疾病，較易直接或間接人與人、動(dòng)物與人、 動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物 三類：可引起人與動(dòng)物疾病，但不構(gòu)成嚴(yán)重威脅，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室 感染很少引起嚴(yán)重疾病，且能有效治療和預(yù)防的微生物 四類：一般不會(huì)引起人與動(dòng)物疾病的微生物41精選ppt 據(jù)對(duì)病原微生物的生物安全防護(hù)水平，按國(guó)家實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則， 將實(shí)驗(yàn)室分為4級(jí)(細(xì)則略) BSL-1：不得從事高致病病原微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí) BSL-2：不得從事高致

14、病病原微生物實(shí)驗(yàn) BSL-3：可從事高致病病原微生物實(shí)驗(yàn)，須經(jīng)國(guó)家認(rèn)可 BSL-4：可從事高致病病原微生物實(shí)驗(yàn)，須經(jīng)國(guó)家認(rèn)可42第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)的條件補(bǔ)充材料及參閱補(bǔ)充材料及參閱P42-5143精選ppt恒定的細(xì)胞恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度生長(zhǎng)溫度 合適的氣體合適的氣體環(huán)境環(huán)境優(yōu)質(zhì)血清優(yōu)質(zhì)血清 合適的細(xì)胞合適的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基無(wú)菌無(wú)毒的細(xì)無(wú)菌無(wú)毒的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境胞培養(yǎng)環(huán)境 培養(yǎng)細(xì)胞的體外生存條件培養(yǎng)細(xì)胞的體外生存條件44精選ppt1. 恒定的溫度:37 o人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.536.50.50.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡o培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力

15、較對(duì)高溫強(qiáng)o人體細(xì)胞在39-40 1小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)o當(dāng)溫度在43以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡45精選ppt2. pH：7.2-7.4o當(dāng)pH低于6.0或高于7.6時(shí)的生長(zhǎng)會(huì)受到影響，甚至死亡。 o酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為pH值的指示劑: 酸性培養(yǎng)液呈橙黃色 堿性培養(yǎng)液呈深紅色 細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些46精選ppt3. 氣體o有調(diào)節(jié)pH值的作用。o開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。o氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。47精選ppt4. 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l保證細(xì)胞滲透壓l培養(yǎng)液里的成分要滿足細(xì)胞進(jìn)行代謝所需要

16、的各種營(yíng)養(yǎng)成分：12種必需氨基酸多種非必需氨基酸碳水化合物(主要是六碳糖)維生素?zé)o機(jī)鹽類48精選ppt動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展過(guò)程l天然培養(yǎng)基階段l合成培養(yǎng)基階段l無(wú)血清培養(yǎng)階段49精選ppt動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)成分氨基酸單糖維生素?zé)o機(jī)鹽促生長(zhǎng)因子及激素促生長(zhǎng)因子及激素適宜的適宜的pH: 7.2-7.4滲透壓：滲透壓：260-320mOsm/kg50精選pptl天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。 4.1 天然培養(yǎng)基天然培

17、養(yǎng)基51精選ppt1951年厄爾開發(fā)了供動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)的人工合成培養(yǎng)基(MEM)合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如DMEM、MEM、IMDM、 RPMI-1640、 M199、Ham12、McCoys 5A等4.2 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基52精選ppt合成培養(yǎng)基優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要4.2 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基53精選ppt培養(yǎng)基的配制舉例培養(yǎng)基的配制舉例RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋碳酸氫鈉 2.0 g青、鏈霉素 各100單位毫升加三蒸水至 1000ml

18、，調(diào)節(jié)pH值至7.24過(guò)夜，過(guò)濾除菌54精選ppt無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子等無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖4.3 無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基55精選ppt無(wú)血清培養(yǎng)基的組成及其主要補(bǔ)充成分（1）激素和生長(zhǎng)因子（2）結(jié)合蛋白（3）貼壁因子和擴(kuò)展因子（4）低分子量營(yíng)養(yǎng)因子4.3 無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基56精選ppt可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平、簡(jiǎn)化了提純、鑒定 各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序使細(xì)

19、胞產(chǎn)品易于純化有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，保證細(xì)胞培養(yǎng)和 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)57精選ppt無(wú)血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便細(xì)胞的適用范圍窄細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和 化學(xué)因素的影響58精選ppt無(wú)血清培養(yǎng)基的應(yīng)用領(lǐng)域無(wú)血清培養(yǎng)基的應(yīng)用領(lǐng)域研究細(xì)胞的分化條件用于激素、生長(zhǎng)因子和藥物等與細(xì)胞相互作用的研究用于從多種細(xì)胞混雜的培養(yǎng)基中選擇目的細(xì)胞腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和

20、生物活性蛋白等生物制品用于干細(xì)胞的研究59精選ppt向無(wú)血清培養(yǎng)液中添加能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物 都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種 細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣無(wú)血清培養(yǎng)基應(yīng)用的局限無(wú)血清培養(yǎng)基應(yīng)用的局限60精選ppt5. 血清血清提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的生長(zhǎng)因子、激素， 提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白， 對(duì)這些物質(zhì)起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用；結(jié)合蛋白還可消除某些 毒素和金屬對(duì)細(xì)胞的毒性作用為貼壁細(xì)胞的附著提供適當(dāng)?shù)馁N壁因子和擴(kuò)展因子提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶

21、的損傷提供 pH 緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、 滲透壓和氣體傳遞速度61精選ppt主要的血清類型主要的血清類型胎牛血清 (fetal bovine serum， FBS)新生牛血清 (new calf serum， NCS)馬血清 (horse serum ，HS)胎牛血清是從母牛剖腹取出的胎牛中分離出的血清價(jià)格昂貴、質(zhì)量最好優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、 支原體、病毒污染62精選ppt血清質(zhì)量好壞是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞 不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10血清血清與細(xì)胞培養(yǎng)血清與細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞需

22、要較高濃度的小牛血清或胎牛血清；對(duì)于 腫瘤細(xì)胞，當(dāng)研究生長(zhǎng)因子、激素對(duì)其影響時(shí)，需要 極低濃度血清或無(wú)血清63精選ppt血清的滅活(消除補(bǔ)體活性):56 ，30分鐘血清的保存、滅活血清的保存、滅活血清貯存:20-70，4可短時(shí)貯存約一個(gè)月。血清分裝：可將4045mL分裝于無(wú)菌50mL離心管或消毒玻璃瓶*血清結(jié)凍時(shí)體積增加約10%，須預(yù)留空間，以防污染或容器凍裂血清過(guò)濾：商業(yè)血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。 若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，37溶解幾分鐘，將血清加入 培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清64精選ppt血清的保存、滅活血清的保存、滅活血清解凍 (逐步解凍法): -20或70至4冰箱 溶解一天，至室

23、溫下全溶后再分裝在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)， 使溫度均一，減少沉淀的發(fā)生勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大， 容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀65精選ppt在一些基礎(chǔ)研究中，往往影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果血清中含有某些不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)或抑制物質(zhì)，對(duì)某些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有去分化作用血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細(xì)胞因子、單克隆抗體等細(xì)胞產(chǎn)品的分離純化帶來(lái)很大困難細(xì)胞培養(yǎng)中血清可能引發(fā)的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中血清可能引發(fā)的問(wèn)題66精選ppt6. 6. 抗生素抗生素在培養(yǎng)基配制后，培養(yǎng)基內(nèi)添加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)通常是青霉素青霉素P.鏈霉素鏈霉素S.聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)P.

24、S.最終使用濃度為每毫升100單位或微克67精選ppt6. 6. 抗生素抗生素建議：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中盡可能不使用抗生素培養(yǎng)污染源很多(比如組織培養(yǎng))，或者珍貴細(xì)胞株才 使用抗生素作脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞最好提前于無(wú)抗生素的 培養(yǎng)基培養(yǎng)，防細(xì)胞死亡68精選ppt0.01M PBS* (pH7.4, 高壓滅菌)組分含量(g/L)NaCl8.0KCl0.2Na2HPO4Na2HPO47H2ONa2HPO412H2O1.44 2.683.58KH2PO40.24H2O10007. 緩沖液緩沖液1PBS(Phosphate-Buffered Sallines)69精選pptHanks 平衡鹽溶液(Ha

25、nks Balanced Salt Solutions, HBSS)成分含量(g/L):CaCl2(無(wú)水氯化鈣)KClKH2PO4MgCl26H2O0.140.400.060.10HBSS70精選ppt8. 消化液消化液作用：分離組織和分散細(xì)胞常用消化液：胰蛋白酶二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)通常使用濃度: 0.25% Trypsin: 0.25g in PBS 0.02%-0.03% EDTA:0.02-0.03g EDTA pH: 7.4；過(guò)濾；-20 保存71精選ppt胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱胰酶)：黃白色粉末，易潮解，冷暗干燥處保存 用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來(lái)

26、自牛或豬的胰腺胰酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，離散細(xì)胞 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去 細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離胰酶簡(jiǎn)介胰酶簡(jiǎn)介8.1 胰蛋白酶胰蛋白酶72精選ppt胰酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的種類和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞通常：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘用含血清培養(yǎng)液可終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用8.1 胰蛋白酶胰蛋白酶73精選pptEDTA是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞毒性小，價(jià)格低廉，使用方便通常與胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，使用濃度見前注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，一定要用Hanks

27、液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 8.2 EDTA4Na 溶液溶液74第三節(jié)第三節(jié) 無(wú)菌操作基礎(chǔ)無(wú)菌操作基礎(chǔ)-清洗與消毒清洗與消毒75精選ppt器皿的清洗和消毒器皿的清洗和消毒P17-20清洗的目的：去雜質(zhì)；去微生物清洗的目的：去雜質(zhì)；去微生物清洗的要求：干凈；無(wú)油跡；無(wú)殘留物清洗的要求：干凈；無(wú)油跡；無(wú)殘留物消毒的目的：防微生物污染消毒的目的：防微生物污染76精選ppt器皿的清洗器皿的清洗l 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗浸泡： 清水浸泡-軟化與溶解附著物 鹽酸浸泡-中和堿性物質(zhì)刷洗：泡酸：有效去雜質(zhì)洗液洗液(清潔液清潔液)的配制：的配制：次強(qiáng)液：重鉻酸鉀 120g, 濃硫酸：2

28、00ml 水： 1000ml強(qiáng)洗液：重鉻酸鉀 63g, 濃硫酸：1000ml 水： 200ml沖洗：去殘留物、去酸液77精選ppt器皿的清洗器皿的清洗l 膠塞的清洗膠塞的清洗水洗：去滑石粉；去雜質(zhì)洗衣粉或2%NaOH煮沸：去蛋白1%HCl中和78精選ppt器皿的清洗器皿的清洗l 塑料制品的清洗塑料制品的清洗使用過(guò)的要及時(shí)浸泡不可反復(fù)使用l 不銹鋼器皿的清洗不銹鋼器皿的清洗去污洗衣液清洗，不可泡酸79精選ppt器皿的消毒器皿的消毒l 物理滅菌法物理滅菌法紫外線消毒：破壞微生物的核酸、蛋白質(zhì)；產(chǎn)生臭氧電離輻射消毒：X射線、g 射線破壞微生物的核酸、蛋白質(zhì)濕熱(高壓蒸汽)消毒：最廣泛、最有效干熱消毒

29、：電熱烤箱法，主要適于玻璃器皿過(guò)濾除菌：0.45uM，可去較大分子；0.22uM可去細(xì)菌80精選pptl 化學(xué)滅菌法化學(xué)滅菌法適于不能用物理消毒法滅菌的物品和場(chǎng)地器皿的清洗器皿的清洗1新潔爾滅: 實(shí)驗(yàn)臺(tái)、細(xì)胞間地面、器械和儀器的浸泡、皮膚擦洗70酒精：擦拭手與皮膚、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、操作臺(tái)等內(nèi)外表面甲醛：廣譜滅菌劑，適于空氣、物體表面環(huán)氧乙烷：廣譜滅菌劑，適于塑料、不耐熱和高壓、不能受潮的物品氯必定：廣譜滅菌劑，適于皮膚、創(chuàng)面戊二醛(2%)：廣譜滅菌劑，適于金屬器械、溫度計(jì)、橡皮、塑料過(guò)氧乙酸：消毒能力強(qiáng)的新型滅菌劑81精選ppt常見消毒法的適應(yīng)對(duì)象常見消毒法的適應(yīng)對(duì)象紫外線消毒紫外線消毒電離輻射消毒電離輻射消毒高壓蒸汽消毒高壓蒸汽消毒干熱消毒干熱消毒過(guò)濾除菌過(guò)濾除