乳酸菌飲料監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)

1、乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)（GB標(biāo)準(zhǔn)）1主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗(yàn)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以鮮乳、乳粉或輔以大豆等為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵加工制成的具 有相應(yīng)風(fēng)味的活性乳酸菌飲料。2引用標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑3術(shù)語乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數(shù)無動(dòng)力， 過氧化氫嗨陰性，革蘭氏陽性的無芽胞桿菌和球菌。乳酸菌菌落總數(shù)：檢樣在一定條件下培養(yǎng)后,所得1mL檢樣中所含乳酸菌菌落的總數(shù)。4設(shè)備和材料4.1 溫箱：36± 1C。4.2 冰箱：04C。4.3 恒溫水?。?6 ± 1C。4.4

2、 電爐：可調(diào)式。4.5 吸管：容量為1, 10和25mL4.6 廣口瓶或三角瓶：容量為 500mL4.7 平皿：直徑為9cm=4.8 試管：18X 180mm4.9 顯微鏡。5培養(yǎng)基和試劑5.1 改良TJA培養(yǎng)基（改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）。5.2 改良 M3養(yǎng)基（Modified Chalmers 培養(yǎng)基）。5.3 0.1%美蘭牛乳培 養(yǎng)基。5.4 6.5%氯化鈉肉湯。5.5 pH9.6葡萄糖肉湯。5.6 40%旦汁肉湯。5.7 淀粉水解培 養(yǎng)基。5.8 精氨酸水解培 養(yǎng)基。5.9 乳酸桿菌糖發(fā)酵管。5.10 七葉吾培養(yǎng)基。5.11 革蘭氏染色液：按 GB 4789.28規(guī)定執(zhí)行。5.12 3咖

3、氧化氫溶液：按 GB 4789.28規(guī)定執(zhí)行。5.13 蛋白腺水、靛基質(zhì)試劑：按 GB 4789.28規(guī)定執(zhí)行。5.14 明膠培養(yǎng)基: 按 GB 4789.28規(guī)定執(zhí)行。5.15 硝酸鹽培養(yǎng)基、硝酸鹽試劑：按 GB 4789.28規(guī)定執(zhí)行。5.16 生理鹽水：定量分裝于三角瓶和試劑管內(nèi)滅菌。6乳酸菌菌落總數(shù)的測定6.1 檢驗(yàn)程序乳酸菌菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序如下：（略）6.2 操作步驟6.2.1 以無菌操作將經(jīng)過充分搖勻的檢樣 25mL（或25g）放入含有225mLX菌生 理鹽水的滅菌廣口瓶內(nèi)作成 1 ： 10的均勻稀釋液。6.2.2 用1mL滅菌吸管吸取1 : 10稀釋液1mL沿管壁徐徐注入含有 9

4、mL滅菌 生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）。6.2.3 另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序,作 10倍遞增稀釋液，如此每遞 增一次，即換用1支1mL滅菌吸管。6.2.4 選擇23個(gè)以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸 取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度作兩個(gè)Wo6.2.5 稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將冷至 50C的乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（改良TJA或改良MC注入平皿約15mL并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾 入加有1mL稀釋液檢樣用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照，以上整個(gè)操作 自培養(yǎng)物加入培養(yǎng)皿開始至接種結(jié)束須在20min內(nèi)完成

5、。6.2.6 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置 36± 1C溫箱內(nèi)培養(yǎng)72± 3h取出，觀察 乳酸菌菌落特征（見表1）,選取菌落數(shù)在30300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算后，隨機(jī)挑取5個(gè)菌落數(shù)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧化氫嗨試驗(yàn)。革蘭氏陽 性，過氧化氫嗨陰性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落 計(jì)算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。例如， 檢樣10-4的稀釋液在改良TJA瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定， 證實(shí)為乳酸菌的是4個(gè)，則1mL檢樣中乳酸菌數(shù)為：6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MW養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)特征見表

6、1。表1乳酸菌在不同培養(yǎng)基上菌落特征（表略）7乳酸菌的鑒定對上述分離到的乳酸菌需進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，則作以下試驗(yàn)。7.1 菌種制備：自平板上挑取菌落，接種于改良 TJA或改良MC京脂斜面，于 36± 1C, 2448h培養(yǎng)，刮取菌苔，分別進(jìn)行下列試驗(yàn)。7.2 乳酸桿菌鑒定試驗(yàn)：極少見還原硝酸鹽，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫 化氫。7.3 常見乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng)，見表 27.4 產(chǎn)乳酸的鏈球菌的鑒別試驗(yàn)，見表 3。表2常見乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng)（表略）表3 乳酸的鏈球菌的鑒別表（表略）附錄A數(shù)種專用培養(yǎng)基及試劑（補(bǔ)充件）A1改良TJA培養(yǎng)基（改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）A1.1

7、成分番茄汁50mL酵母抽提液5g肉膏10g乳糖20g葡萄糖2gK2HPO42g吐溫801g乙酸鈉5g瓊脂15g水加至.1000mLpH6.8土 0.2A1.2 制法番茄汁的制作：將新鮮番茄洗凈,切碎 （切勿搗碎），放入三角燒瓶，置 4C冰 箱812h,取出后用紗布過濾即成。如一次使用不完，可將其置入 0C冰箱，可保 存四個(gè)月。使用時(shí)讓其在常溫下自然溶解。制法：將所有成分加入蒸偕水中，加熱溶解，校正 pH6.8土 0.2。分裝燒瓶，高 壓滅菌121C 1520min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷至 50 C時(shí)使用。A2改良M3養(yǎng)基A2.1 成分大豆蛋白腺5g牛肉浸膏5g酵母浸膏5g葡萄糖20g乳糖碳酸

8、鈣瓊脂蒸偕水20g10g15g1000mL1的性紅溶液5mL硫酸多粘菌素B（酌情而加）10萬國際單位A2.2 制法將前面7種成分加入蒸偕水中，加熱溶解，校正pH6,加入中性紅溶液。分裝燒瓶，高壓滅菌121C1520min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷至 50C,酌情加或不加 硫酸多粘菌素B（檢樣有胖聽或開罐后有異味等懷疑有雜菌污染時(shí)，可加多粘菌素B, 混勻后使用）。A3 0.1%美蘭牛乳培 養(yǎng)基新鮮脫脂牛乳90mL1彖蘭水溶液10mLA4 6.5%氯化鈉肉湯肉浸液（PH7.6）100mL氯化鈉6gA5 pH9.6葡萄糖肉湯普通肉湯校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。A6 40%旦汁肉湯pH7.6肉浸液

9、60mL葡萄糖0.12g牛膽汁40mLA7淀粉水解培 養(yǎng)基PH7.6肉浸液瓊脂90mL羊血清5mL3蜓粉溶液10mLA7.1將肉浸液瓊脂溶化。A7.2 待冷至50C左右以無菌操作加入淀粉溶液及無菌羊血清混合后，傾注平板。A8精氨酸水解培 養(yǎng)基蛋白腺0.1g氯化鈉0.5g磷酸氫二鉀0.6gL精氨酸1g1.6%甲酚紫酒精溶液1.4mL瓊脂0.3g蒸偕水100mLpH7.2A9乳酸桿菌糖發(fā)酵管A9.1 基礎(chǔ)成分牛肉膏5g蛋白腺5g酵母浸膏5g吐溫 800.5mL瓊脂1.5g1.6%溯甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸偕水1000mLA9.2按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管A10七葉吾培養(yǎng)基蛋白腺5g磷酸氫二鉀1g七葉吾3g枸椽酸鐵0.5g1.6%漠甲