DNA-蛋白質的相互作用

1、DNA-蛋白質相互作用的研究方法張利博引言1.很多細胞的生命活動涉及到特定的DNA區(qū)段與特殊蛋白質結合因子之間的相互作用：DNA的復制和重組；mRNA的轉錄和修飾；病毒的感染與增殖等2.隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究顯得尤為重要。而基因表達調控是功能基因組學的一個重要研究領域。而要深入研究基因表達調控的分子機制必須要研究DNA與蛋白質的相互作用。3.在重組DNA技術發(fā)展以來，已相繼分離到大量的具有重要生物學意義的基因。在這種情況下科學工作者開始把自己的研究興趣逐漸轉向DNA結合蛋白這一課題上。 凝膠阻滯試驗DNaseI足跡試驗甲基化干擾試驗體內(nèi)足跡試驗酵母單雜交技術染色質

2、免疫沉淀技術噬菌體展示技術核酸適體技術生物信息學方法蛋白質芯片技術及納米技術 一、凝膠阻滯試驗（DNA遷移率變動試驗DNA mobility shift assay）1 原理：在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質結合，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應縮短了。 2 主要步驟及內(nèi)容： 制備探針DNA （P32放射性同位素標記DNA）同細胞蛋白質提取物一道溫育，形成DNA-蛋白質復合物。將它加樣到非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，進行電泳分離。應用放射自顯影技術顯現(xiàn)具放射

3、性標記的DNA條帶位置 不存在與DNA結合的蛋白質時存在與DNA結合的蛋白質時 凝膠阻滯試驗不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定DNA片段結合的蛋白質分子(比如特異的轉錄因子等)，而且還可以用來研究發(fā)生此種結合作用之精確的DNA序列的特異性 超量的非標記的競爭DNA (competitor DNA ）材料及試劑：2X結合緩沖液：20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-標記探針緩沖液C：20 mM HEPES p

4、H 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM 二硫蘇糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA4%天然的聚丙烯酰胺凝膠(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷，41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（過硫酸銨）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴烷電泳緩沖夜。填充染料：0.2% 溴酚藍、0.2%二甲本藍、50% 甘油操作步驟：1.配置反應混合液：探針DNA (1 ng/ml) 0.1ml、dH20 6.3 ml、2x 結合緩沖液 12.5 ml、BSA

5、 (10 mg/ml) 1.0 ml 、poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、2.在細胞提取物中加入緩沖液C至5 ml。3.加1015 mg上述溶液（ 5 ml)到反應混合物中，總體積應不大于25 ml。4.在室溫下培養(yǎng)20min。5.加入2.5 ml的填充染料。6.裝載樣品到4%的聚丙烯酰胺凝膠柱中。7.室溫下跑電泳2.5h，至溴酚藍距底部1cm處停止。8.80下干燥凝膠，進行放射自顯影處理。 二、DNaseI足跡試驗(DNaseI footprinting assay) DNaseI足跡試驗是一種測定DNA結合蛋白在DNA上的準確結合位點的技術。 首先是單鏈標記，然后用D

6、NaseI水解單鏈標記的雙鏈DNA，產(chǎn)生“DNaseI保護”，尿素變性，PAGE分離及放射性顯影，形成以相差一個核苷酸為梯度的一系列DNA條帶，在此顯影圖中相應于DNA結合蛋白的位置上由于DNA結合蛋白的保護作用而形成了空白區(qū)域。如果在電泳時結合DNA化學測序，則可準確判斷出結合區(qū)的精確序列。三、甲基化干擾試驗根據(jù)DMS （二甲基亞藍）能使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理而設計 先用DMS處理DNA；（并控制反應條件，使之達到平均每條DNA分子只有一個殘基被甲基化）將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結合蛋白的適當細胞提取物一道溫育；并做凝膠阻滯試驗。經(jīng)電泳分離

7、后，從凝膠中切除具有結合蛋白的DNA條帶和沒有結合蛋白的DNA條帶，并用六氫吡啶處理之。 檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質結合作用會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間的相互作用模式。 DMS化學干擾只能在G和A殘基甲基化，不能使T和C甲基化。 故本實驗為足跡實驗的補充手段。四、酵母單雜交技術 真核生物中 ，轉錄因子中DNA 結合結構域(DNA-binding domain BD)與轉錄激活結構域( activationdomain AD) 能夠相互獨立發(fā)生作用。 酵母中的轉錄因子GAL4 的DNA結合結構域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達的蛋白能與目的基因相互

8、作用同樣可通過轉錄激活結構域激活RNA聚合酶啟動下游報告基因的轉錄 。設計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質粒并將其轉入酵母中; 將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒轉化入同一酵母中;若文庫蛋白與目的基因相互作用可通過報告基因的表達將文庫蛋白的編碼基因篩選出來. 注：這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA 片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結合蛋白. 酵母單雜交技術廣泛用DNA與蛋白相互作用的研究。不足以充分反映生理條件下，DNA與蛋白質相互作用的真實情況。因為，高等生物的基因組有染色質結構，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA與蛋白質，在生理狀

9、態(tài)下，這段DNA很可能并不與其相對應的因子相結合。另外，染色質結構本身是動態(tài)的，DNA與非組蛋白在生理狀態(tài)下的相互作用通常是瞬時的，以上方法難以捕捉到發(fā)生在染色質上的基因表達調控的瞬時事件 以上技術都有一定的局限性八、染色體免疫沉淀技術Chromatin immunoprecipitation （ChIp）1.技術介紹 在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，超聲波將染色質打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復合體。只有與目的蛋白結合的DNA片段才能夠被沉淀下來2、主要步驟及內(nèi)容細胞的甲醛固定超聲波斷裂染色質氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質 染色質免疫沉淀和免疫沉淀復合

10、體的純化 交聯(lián)反應的逆轉和DNA的純化染色質免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質在DNA上結合位點的鑒定目的蛋白和DNA靶序列特異結合的進一步驗證 1.細胞的甲醛固定 在1%甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質上的氨基包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側鏈氨基與另外的DNA和蛋白質上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布。加入甘氨酸來終止交聯(lián)反應。 2.超聲波斷裂染色質 甲醛交聯(lián)后的染色質對限制酶和DnaseI高度抵抗，因此通常使用超聲波使得染色質斷裂。打斷后的染色質片段的平均長度應該在500-1000bp左右。（可以用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定）3.氯

11、化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質 氯化銫等密度離心可以除去未交聯(lián)的蛋白質、DNA和RNA樣品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸鈉，通常在4000rpm離心72h。離心后，用連接到蠕動泵的0.25mm毛細管從梯度的底部分步收集染色質組分，在4透析過夜。 4.染色質免疫沉淀和免疫沉淀復合體的純化 用目的蛋白特異性的抗體進行染色質免疫沉淀。抗體的量要進行優(yōu)化防止非特異的結合。用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀復合體。經(jīng)過洗滌除去非特異結合的染色質后，用1%SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合體。 5.交聯(lián)反應的逆轉和DNA的純化在免疫沉淀復合體中加入不含Dnase的Rn

12、ase，proteinase K。65保溫6h使交聯(lián)逆轉。經(jīng)酚氯仿抽提-乙醇沉淀純化DNA。純化的DNA極少，可用色譜定量。6.染色質免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質在DNA上結合位點的鑒定 染色質免疫沉淀的DNA的分析方法有許多種。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狹縫雜交和PCR分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因組上的分布情況,找出反式作用因子的結合位點,可以采用Southern雜交、ChIP克隆和DNA芯片方法。 7.目的蛋白和DNA靶序列特異結合的進一步驗證 染色質免疫沉淀分析得到的結果有很大一部分是假陽性，需要采用其他方法驗證結果的真實性。用PCR方法進行獨立的ChIP分析、電泳遷移率變動分析、酵母單雜交系統(tǒng)及熒光素酶報告系統(tǒng)最終確定目的蛋白與靶DNA序列的特異性結合。 近年來發(fā)展起來的基因芯片（chip）染色質免疫沉淀ChIP技術相結合(chip-ChIP)的方法要一個PCR步驟來擴增染色質免疫沉淀富集的DNA。特異性染色質免疫沉淀的DNA和對照DNA的PCR產(chǎn)物分別用Cy5和Cy3熒光光標記，用于與含有整個基因組的DNA芯片進行