COX-2抑制劑在心肌缺血再灌注損傷中抗凋亡作用及機(jī)制的研究

1、COX-2抑制劑在心肌缺血再灌注損傷中抗凋亡作用及機(jī)制的研究眾所周知 , 缺血性心臟病( Ischemic heart disease,IHD ), 又名冠狀動(dòng)脈粥 樣硬化性心臟病(冠心病) , 是冠狀動(dòng)脈血管由于動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管 腔狹窄或阻塞 , 導(dǎo)致心肌缺血、缺氧甚至壞死而導(dǎo)致的心臟病。缺血性心臟病已 成為嚴(yán)重危害人類健康的頭號(hào)殺手 ¹ 。治療缺血性心臟病最有效的方法為溶血栓療法( thrombolytic therapy )或 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療( primary percutaneous coronary interventio

2、n )開(kāi)通 血管, 恢復(fù)血流 , 但血液供應(yīng)的恢復(fù)往往造成心肌組織的進(jìn)一步損傷 , 稱為“心肌 缺血再灌注損傷( myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI )” ^2,3 。隨著對(duì)凋亡在缺血性心肌病中作用認(rèn)識(shí)的加深 , 以及環(huán)氧化 酶-2 (Cycloxygenase-2,COX-2 )選擇性抑制劑的廣泛應(yīng)用,深入了解COX-2如何 影響心肌細(xì)胞凋亡具有深遠(yuǎn)的臨床意義。環(huán)氧化酶(Cycloxygenase,COX)是前列腺素合成過(guò)程中的限速酶。COX有 COX-1和 COX-2兩種亞型，二者都能夠催生花

3、生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化。COXR初因前列腺素的促炎癥作用被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)息息相關(guān),包括血管舒 張、組織水腫和疼痛。大量證據(jù)表明在心肌缺血過(guò)程中 ，心肌細(xì)胞中COX-2表達(dá) 水平顯著增高,且心肌梗死時(shí)細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度與 COX-2表達(dá)水平呈正相關(guān) ⁴ 。動(dòng)物模型中,采用COX-2特異性抑制劑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理后，動(dòng)物的心功能 明顯提高 , 心肌梗死面積也有所下降。在 MI/RI 過(guò)程中 ,PI3K/Akt 信號(hào)通路還可 以激活基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的蛋白。Akt磷酸化激活核因子K B抑制子激酶a ,IKK- a的活化導(dǎo)致核因子k B抑制 子磷酸化并泛素化降

4、解,導(dǎo)致NFk B的兩個(gè)亞基p65和p50被釋放且磷酸化入核, 從而轉(zhuǎn)錄激活下游促存活蛋白。在 MI/RI 過(guò)程中 , 壞死細(xì)胞的產(chǎn)生一般發(fā)生在缺 血時(shí)間較長(zhǎng)的情況下 , 并且壞死的心肌細(xì)胞一般會(huì)位于心肌梗死區(qū)域的中央。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡 , 是一種由基因控制的程序性死亡。凋亡在 正常生理?xiàng)l件下維持著機(jī)體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài) ,清除組織器官中非必要和一些功能紊亂 的細(xì)胞。NO能夠調(diào)節(jié)能量代謝、參與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等一系列生物學(xué)事件，還具 有神經(jīng)遞質(zhì)和激素的作用。生理狀態(tài)下,NO作為體內(nèi)主要的舒張血管的活性物質(zhì) 具有維持血管張力的功能 ,能夠擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈 , 并起到調(diào)節(jié)心肌舒張與收縮的作 用。

5、NO在 MI/RI過(guò)程中的作用比較復(fù)雜,既能發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的損傷作用 又能保護(hù)心肌細(xì)胞免受凋亡。NO在體內(nèi)主要來(lái)源于一氧化氮合成酶催化 L-精氨 酸產(chǎn)生。到目前為止,并沒(méi)有研究表明在MI/RI過(guò)程中,局部缺血誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)與 細(xì)胞凋亡之間是否存在關(guān)聯(lián)？COX-2的表達(dá)是否會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞激活信號(hào)分子的 表達(dá)水平改變,如Akt、iNOS等？抑制COX-2舌性如何保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷?本 論文通過(guò)缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn),模擬心肌缺血再灌注過(guò)程,在心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞和 原代大鼠心肌細(xì)胞中探究COX-2表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡之間潛在聯(lián)系及分子機(jī)制。 本論文所得到的結(jié)果如下：(1) H/R處理組的H9

6、C2細(xì)胞LDH釋放量明顯高于對(duì) 照組細(xì)胞,這提示我們H/R處理組心肌細(xì)胞的損傷模型構(gòu)建成功。而加入NFk B抑制劑錦雞菌素(Helenalin )處理后,心肌細(xì)胞的LDH釋放量 減弱。說(shuō)明NFk B相關(guān)信號(hào)通路在心肌細(xì)胞 H/R過(guò)程中扮演重要角色。(2) 經(jīng)過(guò)H/R處理后,H9C2細(xì)胞I k Ba蛋白的表達(dá)下降，1 k Ba的磷酸化水 平升高,p65的磷酸化水平升高，C0X-2的表達(dá)量升高；加入Helenalin抑制的H/R 處理組的H9C2細(xì)胞中,p65的磷酸化水平和COX-2蛋白的表達(dá)水平較單純H/R處 理組有顯著下降。說(shuō)明 NFk B介導(dǎo)H/R條件下H9C2心肌細(xì)胞COX-2表達(dá)水平的

7、上升。(3) H/R處理組的H9C2細(xì)胞COX-2的活性明顯高于對(duì)照組細(xì)胞；而H/R處 理同時(shí)加入抑制劑NS398的H9C2細(xì)胞COX-2的活性明顯低于單純的H/R處理組 H9C2細(xì)胞,H9C2細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量明顯少于單純的 H/R處理組H9C2 細(xì)胞，而H/R處理同時(shí)加入抑制劑NS398能有效的減弱H/R處理導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞 活力下降。說(shuō)明COX-2的活性抑制能減弱H/R處理導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。(4) 在H/R處理的H9C2細(xì)胞中，Bcl2的表達(dá)水平明顯減低，cleaved capase-3的表達(dá)水平明升高，凋亡細(xì)胞的比例明顯升高，在NS398預(yù)處理組的 H9C2細(xì)胞中clea

8、ved caspase-3的表達(dá)明顯降低,Bcl2表達(dá)水平升高，凋亡細(xì)胞 的比例明顯少于單純的H/R處理組細(xì)胞。說(shuō)明H/R后COX-2表達(dá)水平上升，引發(fā) 細(xì)胞凋亡，而抑制COX-2活性能夠減輕H9C2細(xì)胞中H/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(5) H/R處理組大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 LDH釋放量升高cleavedcaspase-3表達(dá)水平升高，活力明顯下降;H/R處理同時(shí)加入抑制劑NS398組的大 鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量降低cleaved caspase-3表達(dá)水平也降低， 細(xì)胞活力恢復(fù)。說(shuō)明抑制COX-2活性能夠緩解原代成年大鼠心肌細(xì)胞中H/R介導(dǎo)的細(xì)胞損傷與凋亡。(6) H/R處理組的H

9、9C2細(xì)胞中促炎癥因子IL6和TNFa的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高;H/R處理同時(shí)加入抑制劑NS398能有效的抑制H/R處理導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞中IL6 和TNFa的轉(zhuǎn)錄水平變化。說(shuō)明 C0X-2促進(jìn)H/R處理的導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞促炎癥 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄。（7）H/R處理組的H9C2細(xì)胞細(xì)胞間的ROS舌性顯著升高；而H/R處理同時(shí) 加入抑制劑NS398能有效減弱H/R處理導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞細(xì)胞間ROS勺活性變化。 說(shuō)明COX-2促進(jìn)H/R處理的導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞細(xì)胞間ROS舌性。（8）聯(lián)合添加抑制劑NS398和LY294002則會(huì)再次降低Akt蛋白的磷酸化水平，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量升高，

10、cleaved caspase-3 表達(dá) 水平明顯上升。說(shuō)明抑制 COX-2活性能夠活化Akt,進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。（9）H/R處理聯(lián)合添加抑制劑 NS398和LY294002組H9C2細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平明顯下降,NO表達(dá)顯著下降,cleaved caspase-3 的表達(dá)水平得到恢復(fù),細(xì) 胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量上升，細(xì)胞的活力被抑制。說(shuō)明在 H/R過(guò)程中,抑制 COX-2活性能夠活化Akt/iNOS/NO信號(hào)通路，進(jìn)而通過(guò)抗細(xì)胞凋亡機(jī)制,發(fā)揮對(duì)心 肌細(xì)胞的保護(hù)作用。本論文得出了如下的結(jié)論：（1） NFk B介導(dǎo)H/R條件下H9C2心肌細(xì)胞COX-2 表達(dá)水平的上升；（2） COX-2的活性抑制能減弱H/R處理導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷；（3）抑制COX-2活性能夠減輕H9C2細(xì)胞中H/R處理導(dǎo)致的細(xì)