細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)09年

1、實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用一、目的要求1了解顯微鏡的基本構(gòu)造和使用方法2 掌握油鏡的原理和使用方法二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理1顯微鏡的基本構(gòu)造光學(xué)部分：接目鏡、接物鏡、照明裝置（聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等）。機(jī)械部分：鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力3油鏡的使用原理 當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層

2、油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。三、器材1永久切片2. 溶液或試劑：香柏油、二甲苯。3. 儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等。四、操作步驟1觀察前的準(zhǔn)備（1）顯微鏡的安置，檢查零件是否齊全，鏡頭是否清潔。（2）調(diào)節(jié)光源2顯微鏡觀察（1）低倍鏡觀察（2）高倍鏡觀察（3）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。 3顯微鏡用畢后的處理觀察完畢，上升鏡筒，用擦鏡紙和二甲苯清洗鏡頭，后將鏡體全部復(fù)原。五、思考題1用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？在載玻片和鏡頭之間滴加什么油？起什么作

3、用？2為什么在使用高倍鏡及油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器的誤操作？實(shí)驗(yàn)二 胞間連絲的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察植物細(xì)胞的胞間連絲，加深對(duì)胞間連絲功能的認(rèn)識(shí)二、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上有許多原生質(zhì)的細(xì)絲，稱(chēng)胞間連絲。相鄰細(xì)胞的胞間連絲相互聯(lián)接，在細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞中起橋粱作用，并使細(xì)胞的各種生理活動(dòng)協(xié)調(diào)一致，使植物體成為統(tǒng)一的有機(jī)體。用合適的植物細(xì)胞為材料，經(jīng)簡(jiǎn)單處理，即能方便地看到胞間連絲。三、實(shí)驗(yàn)材料紅辣椒表皮細(xì)胞臨時(shí)裝片、柿胚乳細(xì)胞間胞間連絲切片四、實(shí)驗(yàn)步驟1.剪取一小塊紅辣椒用小刀小心刮除果肉2.將上述刮除果肉后極薄的表皮放在載玻片上，滴一滴水，蓋上蓋玻片，即可往顯微鏡下觀察。鏡檢時(shí)光

4、線宜稍暗。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪圖：胞間連絲圖實(shí)驗(yàn)三 密度梯度提取葉綠體一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饷芏忍荻忍崛∪~綠體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：在不同的密度梯度條件下離心，葉綠體和沉降系數(shù)比它小的物質(zhì)會(huì)停留在不同梯度的交界處，而其它細(xì)胞組分怎會(huì)沉淀咋離心管的底部。三、實(shí)驗(yàn)試劑：15%蔗糖溶液；1000ml50%蔗糖溶液；1000ml勻漿介質(zhì)； 1000ml四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.選取新鮮的嫩菠菜葉片，洗凈擦干后去除葉梗和粗脈，撕成小碎塊，稱(chēng)5g放于研缽中，加入10ml勻漿介質(zhì)，迅速研磨。 2.勻漿液用2層紗布過(guò)濾于50ml燒杯中。 3.將濾液平分到2個(gè)離心管中，天平配平，1000r/min下離心2min。棄去沉淀。 4.

5、取新的離心管分別加入15%和50%蔗糖溶液各1.5ml形成梯度，在加入2ml的上清液5.在5000r/min下離心20min。棄去上清，沉淀即為葉綠體。 6.取一滴葉綠體懸液滴于載片上，加蓋片觀察：五、作業(yè)1.葉綠體是否分離純凈？分析原因？2.整個(gè)實(shí)驗(yàn)要在低溫下迅速完成是何道理？實(shí)驗(yàn)四 PEG誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞融合的基本原理,并掌握PEG誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚體,它可改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu), 使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類(lèi)分子發(fā)生疏散和重組,此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能,從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合.。三、

6、實(shí)驗(yàn)試劑生理鹽水；GKN 液；Alsver 液；50%聚乙二醇四、實(shí)驗(yàn)步驟 采取雞血加入Alsver 液取混合液1ml加入4ml生理鹽水混合液1200r/min，離心三次，5min,5min,10min取血細(xì)胞沉淀加入適量GKN 液稀釋取適量稀釋液滴于載玻片滴加PEG（稀釋液的1/2）靜置3min鏡檢五 作業(yè)圖繪所觀察到的細(xì)胞融合。實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩参锛?xì)胞骨架處理及染色方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理：用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮蘭R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

7、。三、 實(shí)驗(yàn)試劑：1、M-緩沖液；2、pH6.8磷酸緩沖液；3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制；4、0.2%考馬斯亮蘭R250；5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液；四、 實(shí)驗(yàn)步驟：1、 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（約1cm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；2、 吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20min；3、 吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次8min；4、 3%戊二醛固定30min；5、 pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次8min；6、 0.2%考馬斯亮蘭R250染色20min；7、 用蒸餾

8、水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪?zhàn)虞d玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。五、 實(shí)驗(yàn)作業(yè)：1、 繪制你所觀察到的植物細(xì)胞骨架圖象；2、 戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實(shí)驗(yàn)中各起什么作用？實(shí)驗(yàn)六 X染色質(zhì)標(biāo)本的制備和觀察一、目的1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確X染色質(zhì)的形態(tài)、數(shù)量、分布特點(diǎn)。2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握X染色質(zhì)標(biāo)本制作方法。3.通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)X染色質(zhì)與X染色體之間的數(shù)量關(guān)系，學(xué)會(huì)核性別的判斷方法。二、材料1.器械：顯微鏡、蓋玻片、載玻片、消毒牙簽、染色缸、試劑瓶-染色和固定、天平、量筒、恒溫水浴箱、白綢2.試劑 乙醇、龍膽紫、硫瑾、巴比妥鈉、HCL、冰醋酸、醋酸鈉、蒸餾水三、方法和步

9、驟1.人口腔粘膜上皮細(xì)胞X染色質(zhì)標(biāo)本制備涂片：簌口后用清潔的消毒牙簽，從頰部?jī)?nèi)側(cè)輕輕刮取少許口腔黏膜上皮細(xì)胞，均勻涂布于潔凈的載玻片上。固定：在涂片未干燥時(shí)用95%酒精固定15分鐘"蒸餾水沖洗。染色：龍膽紫染色法：1-2分鐘，用水沖洗，油鏡觀察。硫瑾染色法：5N Hcl（220C）中10分鐘"蒸餾水沖洗"染色30分鐘"用水沖洗"油鏡觀察。2.人口腔粘膜上皮細(xì)胞X染色質(zhì)標(biāo)本觀察油鏡觀察"50個(gè)可數(shù)細(xì)胞"X染色質(zhì)出現(xiàn)率正常值：男性，低于1%；女性，高于10%。四、注意事項(xiàng)1.刮取口腔粘膜上皮細(xì)胞時(shí)不宜用力過(guò)大，涂片時(shí)盡量使其均勻

10、，最好能使細(xì)胞成單層分散平鋪。2.Hcl水解掌握好時(shí)間和溫度。3.染色時(shí)間需掌握好，必要時(shí)可分別不同時(shí)間染色。4.計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核必須完整無(wú)缺，無(wú)皺褶，染色均勻。五、染液配制方法(學(xué)生不做)1.龍膽紫染液配制法：冰醋酸30ml、龍膽紫0.75g、蒸餾水70ml。先加溫使龍膽紫溶于冰醋酸中，晾涼后再加蒸餾水。2.硫瑾原液配制法：硫瑾4g、50%酒精100ml。配制成100ml硫瑾液。在與緩沖液混合前過(guò)濾。3.緩沖液配制：醋酸鈉1.94g、巴比妥鈉2.94g、加蒸餾水至100ml冰箱保存。4.硫瑾工作液配制法：按下列順序混合，飽和硫瑾100ml、0.1NHCl70ml、緩沖液60ml。調(diào)至PH5

11、.7冰箱保存。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.繪出細(xì)胞X染色質(zhì)圖，表明細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、X染色質(zhì)四部分。2.寫(xiě)出男女X染色質(zhì)正常值。實(shí)驗(yàn)七 光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞和細(xì)胞器及其顯微測(cè)量一、 目的與要求1、判斷和識(shí)別光學(xué)顯微鏡下各種細(xì)胞器的形態(tài)，大小和數(shù)目；2掌握普通光學(xué)顯微鏡及測(cè)微尺的使用方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞器往往由特殊物質(zhì)組成，因而可通過(guò)對(duì)特異物質(zhì)的區(qū)別染色把各種結(jié)構(gòu)區(qū)分開(kāi)束，每種細(xì)胞器都有特殊的形態(tài)、大小、分布位置及數(shù)目，這也是我們判斷。識(shí)別細(xì)咆器的依據(jù)。而每種細(xì)胞器在不同細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的形態(tài)大小會(huì)有所不同。所以細(xì)胞器的觀察可用來(lái)判斷細(xì)胞的生理狀和發(fā)育情況。細(xì)胞的大小和形態(tài)依細(xì)胞種

12、類(lèi)不同各異，因此，測(cè)量細(xì)胞體積首先要用測(cè)微尺測(cè)出細(xì)胞的長(zhǎng)半徑和短半徑。常用的測(cè)微尺有目鏡測(cè)微尺和物鏡測(cè)微尺兩種。目鏡測(cè)微尺為一塊圓形的薄玻璃片，直徑2021mm，正好能放入目鏡的鏡筒內(nèi)，其上面刻有不同形式的標(biāo)尺。標(biāo)尺有直線式和網(wǎng)格式兩種，直線式又分為“十”字形和“一”字形兩種。直線式測(cè)微尺總長(zhǎng)10mm，分為10大格，其上有數(shù)字指示，每一大格又分10小格，共100小格。網(wǎng)格式測(cè)微尺常用來(lái)測(cè)量面積或計(jì)數(shù)。物鏡測(cè)微尺是一種特制的載玻片，其中央有一個(gè)圓圈，圈內(nèi)具有一個(gè)有刻度的標(biāo)尺，為直線式標(biāo)尺，全長(zhǎng)1mm，分為10大格，每大格又分10小格，共100小格，每小格長(zhǎng)度為0.01mm。由于目鏡測(cè)微尺刻度的長(zhǎng)

13、度隨物鏡放大倍數(shù)不同而有改變，所以用目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞前，首先要測(cè)定目鏡測(cè)微尺的長(zhǎng)度，即使用物鏡測(cè)微尺來(lái)確定目鏡測(cè)微尺刻度的長(zhǎng)度，然后再以目鏡測(cè)微尺上的刻度作為測(cè)量細(xì)胞時(shí)的度量單位。三、 材料和用具顯微鏡、載玻片、蓋玻片、干消毒棉球、試管、滴管、目鏡測(cè)微尺、物鏡測(cè)微尺、75乙醇、紅細(xì)胞稀釋液、苔蘚、洋蔥根尖切片。四、 操作與觀察：1、用目鏡測(cè)微尺分別在高倍鏡下和油鏡下測(cè)量鏡臺(tái)測(cè)微尺，從而算出稱(chēng)所用顯微鏡中目鏡測(cè)微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。2、用高倍鏡及油鏡檢測(cè)各種切片，并且用目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞和細(xì)胞核的長(zhǎng)、短徑的長(zhǎng)度。3選取細(xì)胞膜和核膜界限清晰的切片或涂片測(cè)量。測(cè)量時(shí)可旋轉(zhuǎn)目鏡（測(cè)微尺)及移動(dòng)載

14、玻片，置被測(cè)細(xì)胞于測(cè)微尺軸線上。4根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算各種細(xì)胞及細(xì)胞核的體積。5將苔蘚洗凈撕取一小塊置于滴有清水的載玻片上，蓋上蓋玻片，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測(cè)量細(xì)胞及細(xì)胞器的大小。為減少誤差，同一標(biāo)本需測(cè)5個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，取其平均值計(jì)算體積。五、 作業(yè)1 你所測(cè)量的各種血細(xì)胞的大小各是多少？2 繪制細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)圖，把你所見(jiàn)到的各種細(xì)胞器繪制在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。注意細(xì)胞器外形特點(diǎn)、大小、分布位置、數(shù)目。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的滲透性及各類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。二、實(shí)驗(yàn)原理 當(dāng)紅細(xì)胞置于不同等滲溶液中時(shí)，由于對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，因此有的溶質(zhì)分子可透入，有的溶質(zhì)分子則不能透入，能透人的溶

15、質(zhì)分 子的速度也不同。當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入紅細(xì)胞使細(xì)胞 內(nèi)溶質(zhì)濃度增加時(shí)，導(dǎo)致水的攝人。紅細(xì)胞膨脹 到一定程度時(shí)，細(xì)胞膜破裂，血紅素溢出即紅細(xì) 胞發(fā)生溶血.由于溶質(zhì)透人速度不同，溶血時(shí)間 也不同. 三、實(shí)驗(yàn)材料材料：雞血試劑：0.17 molL氯化鈉，0.17 molL 氯化銨，0.17 molL硝酸鈉，0.12 molL硫酸 鈉，0.10 molL草酸鈉，0.10molL醋酸鈉， 0.32 molL葡萄糖，0.32 molL甘油，0.32 molL乙醇，0.32molL丙醇。 儀器：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管、小燒杯、試管、秒表。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.雞用注射器耳靜脈取血，取小燒杯2只，分別加1份經(jīng)肝

16、素抗凝的雞血和10份0.17molL氯化鈉， 成為一種不透明的紅色液體，此即稀釋的雞血。 2.取試管1支，加入10mL蒸餾水，然后再加入1 mL稀釋的雞血，注意觀察溶液的顏色變化，溶液由不透明的紅色變?yōu)榧t色透明，紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成所有紅細(xì)胞溶血，使光線容易通過(guò)。顯微鏡下觀察溶血前后紅細(xì)胞的形態(tài)。 3.觀察紅細(xì)胞對(duì)各類(lèi)物質(zhì)的滲透性:取試管10支，分別加入上述10種溶液各5 mL，再 加入0.5mL稀釋的雞血，記下時(shí)間，輕輕搖動(dòng)使混勻，注意是否發(fā)生溶血；若發(fā)生溶血，記錄溶血過(guò)程所需的時(shí)間。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告試管編號(hào) 溶液種類(lèi) 是否溶血 溶血所需時(shí)間 結(jié)果分析12345678910實(shí)驗(yàn)九DNA的Feu

17、lgen染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察蠶豆、洋蔥根尖細(xì)胞或其他根尖細(xì)胞內(nèi)的染色體，以及染色體在有絲分裂中的行為，掌握Feulgen染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理這是Feulgen于1924年提出的一種鑒別細(xì)胞中DNA組織的化學(xué)方法。細(xì)胞中的DNA在60下用1mol/L HC1酸解，使脫氧核糖與嘌呤堿之間的糖苷鍵破壞，嘌呤堿脫掉，從而使脫氧核糖中潛在的醛基游離。游離的醛基與Schiff試劑結(jié)合，形成一種紫色的復(fù)合物。酸解的條件很重要。若溫度低、酸度不夠，醛基暴露不充分，染色會(huì)過(guò)淺；相反，若酸解過(guò)分，會(huì)造成DNA完全解聚，從而使水解液中Schiff反應(yīng)增強(qiáng)，而染色體的染色反應(yīng)減弱。由于RNA在酸的作用下比DNA穩(wěn)

18、定，醛基難以被游離，所以，不能被著色。這就是孚爾根反應(yīng)對(duì)DNA有特異性染色的原因。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 （一） 儀器、用具顯微鏡、恒溫水浴箱、溫度計(jì)、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙。（二 ）材料洋蔥鱗莖或根尖（三）試劑11MHCl的配制取82.5ml比重1.19的濃HCl加蒸餾水至1000ml 。2Schiff試劑的配制及保存稱(chēng)取0.5g堿性品紅加入到100ml煮沸的蒸餾水中（用三角燒瓶），時(shí)時(shí)振蕩，繼續(xù)煮 5分鐘（勿使之沸騰），使之充分溶解。然后冷卻至50時(shí)用濾紙過(guò)濾，濾液中加入10ml 1MHCl，冷卻至25時(shí)，加入0.5g Na2S2O5（偏重亞硫酸鈉或鉀），充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處?kù)o置至少24小時(shí)（有時(shí)需23天），使其顏色退至淡黃色，然后加入0.5g活性炭，用力振蕩1分鐘，最后用粗濾紙過(guò)濾于棕色瓶中，封嚴(yán)瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無(wú)色也無(wú)沉淀，貯于4冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色時(shí)，仍可再用。3亞硫酸水取200ml