轉(zhuǎn)化及重組子的初步篩選實(shí)驗(yàn)課件

1、實(shí)驗(yàn)六 轉(zhuǎn)化及重組子的初步篩選 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 實(shí)驗(yàn)原理3. 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑4. 實(shí)驗(yàn)步驟 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)?zāi)康膙了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義；v學(xué)習(xí)外源dna轉(zhuǎn)化入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化子的方法。 實(shí)驗(yàn)原理v轉(zhuǎn)化（transformation）是將異源dna分子導(dǎo)入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段。其原理是細(xì)菌處于0， cacl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。v轉(zhuǎn)化混合物中的dna形成抗dna酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收dna復(fù)合物。進(jìn)入細(xì)胞的dna分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞

2、出現(xiàn)新的遺傳性狀。v將經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體(transformant)，即帶有異源dna分子的受體細(xì)胞。 dna重組重組v外源基因插入與否可通過(guò)載體上的lac z基因進(jìn)行初步的篩選。有外源基因插入的細(xì)菌呈白斑，無(wú)外源基因插入的細(xì)菌呈藍(lán)斑。alfaalfa互補(bǔ)互補(bǔ)v藍(lán)白斑篩選原理：藍(lán)白斑篩選原理：v藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的dna的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacz）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。v在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（mcs），它并不破壞讀框，但

3、可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶c端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。v這樣，lacz基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的lacz+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑iptg的作用下，在生色底物x-gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。v然而，當(dāng)外源dna插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。v如用藍(lán)白斑篩選則

4、經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑（一）儀器 v1. 恒溫?fù)u床 v2. 超凈工作臺(tái) v3. 恒溫水浴鍋 v4. 恒溫箱 v5. 微量取液器 （二）材料 v1. 實(shí)驗(yàn)四所得連接產(chǎn)物 v2. 實(shí)驗(yàn)五制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 （三）試劑v1. lb固體培養(yǎng)基 v2. 氨芐青霉素（amp） 100mg/ml 實(shí)驗(yàn)步驟 轉(zhuǎn)化: v1取適量連接產(chǎn)物加到分裝的200 l感受態(tài)細(xì)胞中，冰上混勻，冰浴30min；此過(guò)程中，需倒含氨芐的lb平板。 v242熱激90s，迅速在冰浴中冷3-5min； v3上述管中加入600l lb培養(yǎng)基，于37振蕩培養(yǎng)45min；此過(guò)程中，在lb平板上涂布x-gal 40 l和iptg 20 l 。v4取適量菌液涂布lb平板(含amp 50g/ml)，室溫涂布均勻后（至菌液完全被吸干），于37倒置，過(guò)夜培養(yǎng)； v5