蒲公英多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)的初步分析

1、蒲公英多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)的初步分析高金波，孫麗娜，滕楊，侯巍gao jin-bo sun li-na teng yang hou wei（黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，佳木斯，154007）（the key laboratory for biological drug of the education department helongjiang .college of phannacy, jiamusiuniversity.hilongjiang jiamusi 154007,china）摘要目的：用超聲波協(xié)同酶法提取蒲公英根多糖，并對(duì)該多糖進(jìn)行分離、純化、分級(jí)和

2、結(jié) 構(gòu)的初步分析。方法：采用超聲波協(xié)同酶法進(jìn)行提取多糖，分離純化后，經(jīng)sephadex g-75 柱分成abcd四級(jí)，采用優(yōu)化的pmp柱前衍生hplc法分析單糖組成。采用紫外、紅外、 高碘酸氧化等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步分析，結(jié)果：四種單糖均含有d鼠李糖、葡萄糖、d半乳 糖、d木糖和d阿拉伯糖；它們的單糖的摩爾比：a的單糖的摩爾比為： rha：glc：gal：xyl：ara=0.098：2.88：0.125：0.017：0.33 , b 的單糖的摩爾比為：rha：glc：gal：xyl：ara=0.113:0.68:0.13:0.011 ：09, c 的單糖的摩爾比為：rha：glc：gal：xyl

3、：ara =0.139:2.46:0.36:0.13:0.086 , d 的單糖的摩爾比為：rha:glc：gal:xyl：ara =0.028:0.36:0.031:0.012:0.94；結(jié)論：四種多糖在結(jié)構(gòu)上有明顯的不同。關(guān)鍵詞：蒲公英；多糖；結(jié)構(gòu)isolation9purification and analysis of glycoproteinfrom taraxacum polysaccharidesabstract： objective the methods of ultrasonic and coordinated enzyme were used to extract pol

4、ysaccharides from taraxacum roots in order to carry out isolation、purification and preliminary analysis of structure. methods polysaccharides were extracted by ultrasonic and coordinated enzyme methods,after separating and purifying, four levels (abcd) were fractionated by sephadex g-75 column and t

5、hen monosaccharide constituents were analyzed by hplc applied to pmp precolumn derivation. preliminary analysis of structure was analyzed by uv ir and periodic acid method. results four kinds of monosaccharides all contain d- rhamnose > glucose > d-galactose and darabinose. their molar ratios

6、are as follow in turns:fraction a: 0.098:2.8&0.125:0.017:0.33,fraction b: 0.113:0.6&0.13:0.011:0.19,fraction c: 0.139:2.46:0.36:0.13:0.086, fraction d: 0.028:0.36:0.031:0.012:0.94. conclusion it showed that there were significant differences in four species of polysaccharideskey word: taraxa

7、cum ; polysaccharide; structure蒲公英屬菊科屬多年生的草本植物，乂名黃花地丁、婆婆丁、黃花郎等?，F(xiàn)在的研究表 明蒲公英的化學(xué)成分不僅有揮發(fā)油、黃酮類、三祜類、香豆精類和倍半內(nèi)酯類，而且富含笛黑龍江省衛(wèi)生廳（項(xiàng)目編號(hào):2007-510） 醇、棕櫚酸和多糖山。多糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，因其具有能量儲(chǔ)存、結(jié)構(gòu) 支持、防御和抗原決定性等多方面的生物學(xué)功能，而口有些多糖或其衍生物還具有多種藥理 活性，所以近年來多糖成為天然藥物研究與開發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)27。所以，本實(shí)驗(yàn)對(duì)研究較少的 蒲公英根中的多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)方面的初步研究。1實(shí)驗(yàn)儀器及試劑蒲公英根（河北省安國市京華藥

8、業(yè)有限公司，由佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室教授劉娟鑒定為蒲 公英根）；agilent 1100化學(xué)工作站（美國agilent公司）；zorbax-c18分析柱（美國agilent公 司）；uv 757型紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、三氟乙酸（tfa,純度鼻 99%）、1 苯基3甲基5毗呻ii林酮（pmp,在使用之前用色譜甲醇重新結(jié)晶2次）、葡萄糖（glc, $99%）、d鼠李糖（rha, $99%）、d半乳糖（gal, $99%） d木糖（xyl, 299%）、d- 阿拉伯糖（am, 299%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙月青（色譜純）天津市光復(fù)精 細(xì)化工研究所；其它實(shí)驗(yàn)試劑均為

9、分析純。2實(shí)驗(yàn)方法2.1超聲波協(xié)同酶法提取、分離及純化蒲公英根中的多糖蒲公英根一粉碎一石油醸、80%的乙醇冋流脫脂、脫低聚糖->50°c熱風(fēng)干燥一稱取適量 的蒲公英根，1:40的料液比，纖維素酶為底物的3%,提取溫度為50°c,提取時(shí)間為25min, ph=5.0,用超聲波法進(jìn)行提取一提取液濃縮至總體積的l/3-sevage法除去蛋白一大孔吸附 樹脂進(jìn)行脫色一95%的乙醇進(jìn)行沉淀一低溫干燥一蒲公英多糖粗品一用濃度為0.05mol/l nacl溶液溶解一離心一取上清液一定容一sephadex g-75柱層析分步收集苯酚硫酸法檢 測(cè)一收集反應(yīng)陽性的高峰部分一體積分?jǐn)?shù)95%

10、的乙醇進(jìn)行醇析一蒲公英精制多糖a、b、c、 do2.2蒲公英根粗多糖的組成分析2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生分別精密稱取葡萄糖0.0396 g> d半乳糖0.0363 g、d木糖和d阿拉伯糖各0.0300 g、 d鼠李糖0.0364 g,溶于10 ml的氨水中，取該溶液100 pl與100 pl pmp/甲醇溶液（0.5 mol/l） 混合，在70°c下反應(yīng)30 min,取出后冷卻至室溫，用1 ml的氯仿萃取，充分振蕩后除去有機(jī) 相，重復(fù)3次。水溶液經(jīng)0.45 pm的微孔濾膜過濾，用水稀釋一定量的倍數(shù)后，進(jìn)行hplc 分析。2.2.2蒲公英根多糖的衍生準(zhǔn)確稱取蒲公英精制多糖5 m

11、g,加入2 mol/l的tfa溶液1 ml封管，110°c水解2 h,得 到多糖的水解樣品溶液，取多糖水解液100卩1按照221項(xiàng)目“與1 ooplpmp/甲醇溶液(0.5 mol/l)混合”開始，進(jìn)行衍生化處理。2.2.3色譜條件色譜柱：zorbax eclipse xdb-c18, 250 mmx4.6 mmi.d., 5 pm；流動(dòng)相：0.1 mol/l 的磷酸鹽緩沖液(ph=6.7)/乙月青(體積比為83:17)；流速：lml/min；紫外檢測(cè)波長：245 nm；進(jìn) 樣量：20(11；柱溫：室溫。2.2蒲公英多糖結(jié)構(gòu)初步分析2.3.1紫外光譜分析稱取精制多糖樣品適量，用蒸惚水

12、配制成一定濃度的溶液，以蒸憾水為空白，在200400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。2.3.2紅外光譜分析取精制多糖樣品適量，用kbi壓片，掃描范圍為4000400cm"。3結(jié)果與討論3.1多糖的組成分析結(jié)果3丄1色譜條件的優(yōu)化為實(shí)現(xiàn)蒲公英多糖各組成單糖的高效分離，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蒲公英多糖中可 能含有的glc、rha、gal、xyl、ara五種標(biāo)準(zhǔn)單糖pmp衍牛物的高效液相色譜分離條件進(jìn)行 了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為磷酸鹽緩沖液(na2hpcunah2po4)的ph為6.7時(shí)，采用等度洗脫的分 離模式能夠使以上5種單糖衍生物得到較理想的分離見圖la。312衍生方法的優(yōu)化 用氨水進(jìn)行衍牛，無需對(duì)反應(yīng)后的溶液進(jìn)行

13、中和，直接用氯仿萃取， 用水稀釋后進(jìn)行hplc分析。簡化了實(shí)驗(yàn)步驟、縮短了樣品的處理時(shí)間，避免了干燥后的衍 生物由于難溶而引起的誤差，結(jié)果使定量更加準(zhǔn)確。如圖la和圖lb,從圖的縱坐標(biāo)可看出 優(yōu)化后峰高均增加近1倍多。多糖樣品的色譜圖見圖2.圖1單糖標(biāo)準(zhǔn)品pmp衍生物色譜圖(a：有干燥過程；b無干燥過程)1、pmp； 2、rha； 3、glc； 4、gal； 5、xyl； 6、arafig 1 chromatogram of pmp derivatives ofmonosaccharides standard (a: with drying； b:without drying)圖2蒲公英多糖h

14、plc圖譜fig 2 ultrasonic synergistic enzymatic extraction of taraxacum polysaccharide hplc chromatogra3.1.3多糖的單糖組成 精制蒲公英多糖a、b、c、d中均含有d鼠李糖、葡萄糖、d半乳 糖、d木糖、d阿拉伯糖等5種單糖，除此之外，還含有其它多種單糖。測(cè)定結(jié)果為：a 的單糖的摩爾比為：rha：glc：gal：xyl：ara=0.098：2.88：0.125：0.017：0.33,b 的單糖的摩爾比為：rha：glc：gal：xyl：ara=0.113:0.68:0.13:0.011:0.19,c

15、的單糖的摩爾比為：rha:glc：gal:xyl：ara =0.139:2.46:0.36:0.13:0.086,d 的單糖的摩爾比為：rha：glc：gal：xyl:ara =0.028:0.36:0.031：0.012：0.94o3.1多糖紫外光譜測(cè)定結(jié)果分級(jí)后的蒲公英多糖在260nm和280nm處均沒有吸收峰，說明蒲公英多糖不含有核酸和 蛋白質(zhì)，在其他波長處無特征吸收峰，符合多糖類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。3.2多糖紅外光譜測(cè)定結(jié)果圖4是用不同濃度nacl溶液洗脫獲得蒲公英多糖紅外光譜圖?？梢钥闯?，糖類分子中含 有大量的oh, o-h伸縮振動(dòng)多在32003600cm"之間出現(xiàn)強(qiáng)而寬的吸

16、收峰。蒲公英多糖在 3421 cm"1有強(qiáng)而寬的吸收峰，為oh的伸縮振動(dòng)峰；2943cm"出現(xiàn)弱吸收，為ch伸縮振動(dòng) 峰；在1700400cm"有明顯的不同的吸收，說明四種多糖在結(jié)構(gòu)上有明顯的不同。rn2) aoueuesusl0 20mot/l n«cio15movlnaa4000350030002500200015001000500wavenumber （cm1）圖4蒲公英多糖的紅外光譜圖o 1omovl m*ci參考文獻(xiàn)1jtuo h s. immunity chinese pharmacy（免疫中藥學(xué)）mj.beijing: peking uni

17、on medical college press, 1999: 188-191.2fu x p, yang x j.extraction and determination of the polysaccharides from dandelion（現(xiàn)代食品科技）j modern food science and technology（食品科學(xué)和）,2007, 23（6）: 3739.卩aimei lu piangui yu protective effects of lentinan on ho-induced oxidative damage in primary cultured rat

18、 cortical neurons（香菇多糖對(duì) 比。2（損傷神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究）j.chinese journal of modem applied pharmacy（中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)）j200&25（5）:393396.4 li g r. study on isolation of lycium barbaruni polysaccharide and its effects on anti-activc oxygen free radicals（枸杞多糖的提取及其對(duì)活性氧 自由基的清除作用）j chinese journal of modern applied pharmacy（中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)）.2002,19（2）:9496.5 cheng je zhang y； he j r. efleet of astragalus polyaaccharidcs（aps）on the decrease of the leukcocytes and the marrow karyotes in chemotherapy mice（黃罠多糖對(duì)小鼠化療中白細(xì)胞和肯冊(cè)冇核細(xì)胞減少的影響）j chinese journal of modem applied pharma