紙層析法分離氨基酸實(shí)用教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1紙層析紙層析(cn x)法分離氨基酸法分離氨基酸第一頁(yè)，共28頁(yè)。第1頁(yè)/共28頁(yè)第二頁(yè)，共28頁(yè)。第2頁(yè)/共28頁(yè)第三頁(yè)，共28頁(yè)。第3頁(yè)/共28頁(yè)第四頁(yè)，共28頁(yè)。二、紙層析(cn x) ( (一一) ) 原理原理 紙上層析實(shí)際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為紙上層析實(shí)際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑固定相，而以有機(jī)溶劑( (與水不相混溶或部分混與水不相混溶或部分混溶溶) )作為流動(dòng)相。展開(kāi)時(shí)，有機(jī)溶劑在濾紙上流作為流動(dòng)相。展開(kāi)時(shí)，有機(jī)溶劑在濾紙上流動(dòng)，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配動(dòng)，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)。由于各物質(zhì)有不同的

2、分配系數(shù)(xsh)(xsh)，移動(dòng)，移動(dòng)速度因此不同，從而達(dá)到分離的目的。速度因此不同，從而達(dá)到分離的目的。 第4頁(yè)/共28頁(yè)第五頁(yè)，共28頁(yè)。第5頁(yè)/共28頁(yè)第六頁(yè)，共28頁(yè)。溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率可用溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率可用RfRf值表示值表示： Rf= X/ Y Rf= X/ Y式中式中X X：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動(dòng)距離：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動(dòng)距離 Y Y：溶劑前沿移動(dòng)的距離：溶劑前沿移動(dòng)的距離 Rf Rf值決定值決定(judng)(judng)于分配系數(shù)。于分配系數(shù)。 不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同物質(zhì)的分配系數(shù)(xsh)不同，不同，Rf值也不相同，由值也不相同，由此可以根據(jù)此可以根據(jù)Rf值的大小對(duì)

3、物質(zhì)進(jìn)行定性分析。值的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。 第6頁(yè)/共28頁(yè)第七頁(yè)，共28頁(yè)。(二二) 影響影響(yngxing)Rf值的主要因素值的主要因素 1.1.物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性 2.2. 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響RfRf值的主要因素值的主要因素。極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其。極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其RfRf值就值就較小，反之亦然。較小，反之亦然。 2. 2.濾紙濾紙 3.3. 不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的水量不一樣，兩相的體積比也就不同。所因此結(jié)合的水量不一樣，兩相的體

4、積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同型號(hào)以同一種物質(zhì)在不同型號(hào)(xngho)(xngho)的濾紙上進(jìn)行層的濾紙上進(jìn)行層析時(shí)，所得到的析時(shí)，所得到的RfRf值也不相同。值也不相同。 4.4. 此外，濾紙上所含的雜質(zhì)也會(huì)影響此外，濾紙上所含的雜質(zhì)也會(huì)影響RfRf值。值。5.5. 第7頁(yè)/共28頁(yè)第八頁(yè)，共28頁(yè)。3.3.層析所用的溶劑層析所用的溶劑 同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行(jnxng)(jnxng)層析時(shí)，層析時(shí)，RfRf值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴(yán)格，才能使值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴(yán)格，才能使RfRf值的值的重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的

5、重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的RfRf值應(yīng)在值應(yīng)在0.05-0.05-0.850.85之間，樣品中被分離組分的之間，樣品中被分離組分的RfRf之差最好大于之差最好大于0.050.05。 溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過(guò)預(yù)處理后才能使溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過(guò)預(yù)處理后才能使用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等第8頁(yè)/共28頁(yè)第九頁(yè)，共28頁(yè)。4.pH4.pH值值 溶劑和樣品的溶劑和樣品的pHpH值會(huì)影響物質(zhì)的解離，從而影響物值會(huì)影響物質(zhì)的解

6、離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使質(zhì)的極性和溶解度，使RfRf值改變。溶劑的酸堿度增大則值改變。溶劑的酸堿度增大則流動(dòng)相的含水量增高，使極性物質(zhì)的流動(dòng)相的含水量增高，使極性物質(zhì)的RfRf值增加；反之則值增加；反之則降低降低(jingd)(jingd)。 為了避免或減少為了避免或減少pHpH值對(duì)值對(duì)RfRf值的影響，可將濾紙和溶值的影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的pHpH值。值。 5.5.溫度溫度 溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用，即影響固定相的體積數(shù)；也影響濾紙

7、纖維的水合作用，即影響固定相的體積. .所以溫度的改變使所以溫度的改變使RfRf值變化很大，為此，層析必須在恒值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。溫條件下進(jìn)行。 第9頁(yè)/共28頁(yè)第十頁(yè)，共28頁(yè)。6.6.展開(kāi)方式展開(kāi)方式 同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同的展開(kāi)方式進(jìn)行層析時(shí)，所得到的用不同的展開(kāi)方式進(jìn)行層析時(shí)，所得到的Rf Rf 值不相值不相同。用下行法展開(kāi)時(shí)，同。用下行法展開(kāi)時(shí)，RfRf值較大；用上行法展開(kāi)時(shí)，值較大；用上行法展開(kāi)時(shí)，RfRf值較?。挥脠A形濾紙層析時(shí)，由于內(nèi)圈較外圈小，值較小；用圓形濾紙層析時(shí)，由于內(nèi)圈較外圈小，限

8、制限制(xinzh)(xinzh)了溶劑的流動(dòng)，了溶劑的流動(dòng)，RfRf值也較小。值也較小。 7.7.樣品溶液中雜質(zhì)樣品溶液中雜質(zhì) 樣品溶液中存在雜質(zhì)時(shí)，有時(shí)對(duì)樣品溶液中存在雜質(zhì)時(shí)，有時(shí)對(duì)RfRf值有所影響值有所影響。例如：氯化鈉的存在會(huì)影響氨基酸的。例如：氯化鈉的存在會(huì)影響氨基酸的Rf Rf 值。值。 第10頁(yè)/共28頁(yè)第十一頁(yè)，共28頁(yè)。(三三) 操作方法操作方法 1.1.樣品處理樣品處理 用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定的的pHpH值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需稀釋。

9、需稀釋。 2.2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣 將濾紙將濾紙(lzh)(lzh)裁成適當(dāng)大小，用鉛筆在距邊線裁成適當(dāng)大小，用鉛筆在距邊線2cm2cm左左右劃一直線右劃一直線( (稱為原線稱為原線) )，線上每隔，線上每隔2-3cm2-3cm劃一圓點(diǎn)劃一圓點(diǎn)( (稱為原稱為原點(diǎn)點(diǎn)) )。然后用點(diǎn)樣器。然后用點(diǎn)樣器( (定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析需用微量注射器需用微量注射器) )輕輕點(diǎn)在原點(diǎn)上。樣品點(diǎn)的直徑約輕輕點(diǎn)在原點(diǎn)上。樣品點(diǎn)的直徑約0.3-0.3-0.5cm0.5cm。點(diǎn)樣的量應(yīng)根據(jù)紙的長(zhǎng)短以及樣品的性質(zhì)來(lái)決定，。點(diǎn)樣的量應(yīng)根據(jù)紙的長(zhǎng)短以及樣品的性質(zhì)來(lái)決定，一般每一樣品的量

10、為一般每一樣品的量為5-30g5-30g。點(diǎn)樣一般采用少量多次，每。點(diǎn)樣一般采用少量多次，每點(diǎn)一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點(diǎn)第二次。每次點(diǎn)樣的位點(diǎn)一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點(diǎn)第二次。每次點(diǎn)樣的位置應(yīng)完全重合，否則會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象。置應(yīng)完全重合，否則會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象。 第11頁(yè)/共28頁(yè)第十二頁(yè)，共28頁(yè)。第12頁(yè)/共28頁(yè)第十三頁(yè)，共28頁(yè)。3.3.平衡平衡 點(diǎn)樣以后展開(kāi)以前先將濾紙與層析缸用配好點(diǎn)樣以后展開(kāi)以前先將濾紙與層析缸用配好的溶液系統(tǒng)的蒸汽來(lái)飽和，這個(gè)過(guò)程稱之為的溶液系統(tǒng)的蒸汽來(lái)飽和，這個(gè)過(guò)程稱之為“平平衡衡”。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑

11、蒸汽飽和，在層析過(guò)程中，濾紙會(huì)從溶劑中吸收水分飽和，在層析過(guò)程中，濾紙會(huì)從溶劑中吸收水分，溶劑也會(huì)從濾紙表面揮發(fā)，從而改變，溶劑也會(huì)從濾紙表面揮發(fā)，從而改變(gibin)(gibin)溶劑系統(tǒng)的組成溶劑系統(tǒng)的組成, ,嚴(yán)重影響層析效果。平衡一般在嚴(yán)重影響層析效果。平衡一般在密閉的層析缸內(nèi)進(jìn)行。密閉的層析缸內(nèi)進(jìn)行。 第13頁(yè)/共28頁(yè)第十四頁(yè)，共28頁(yè)。4.4.展開(kāi)展開(kāi) 平衡結(jié)束平衡結(jié)束(jish)(jish)后，將濾紙靠樣品點(diǎn)的一后，將濾紙靠樣品點(diǎn)的一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm1cm，此，此時(shí)即開(kāi)始展開(kāi)。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)濾紙另一端時(shí)即開(kāi)始展開(kāi)。當(dāng)溶

12、劑前沿到達(dá)濾紙另一端0.5-0.5-1cm1cm處時(shí)，展開(kāi)結(jié)束處時(shí)，展開(kāi)結(jié)束(jish)(jish)，取出濾紙，在溶，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標(biāo)記，晾干或用冷風(fēng)吹干。劑前沿處做一標(biāo)記，晾干或用冷風(fēng)吹干。 按溶劑在濾紙上流動(dòng)的方向不同，展開(kāi)有上按溶劑在濾紙上流動(dòng)的方向不同，展開(kāi)有上行、下行和環(huán)行三種方式。行、下行和環(huán)行三種方式。 (1) (1) 上行法：將濾紙點(diǎn)樣的一端向下浸入溶上行法：將濾紙點(diǎn)樣的一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細(xì)管引力的作用從下向上流動(dòng)。劑中，溶劑因毛細(xì)管引力的作用從下向上流動(dòng)。 上行法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，是最常用的展開(kāi)方上行法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，是最常用的展開(kāi)方法，但展開(kāi)時(shí)間

13、較長(zhǎng)。法，但展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng)。 (2) (2) 下行法：在層析缸上部有一盛展開(kāi)劑的下行法：在層析缸上部有一盛展開(kāi)劑的液槽，將濾紙點(diǎn)樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主液槽，將濾紙點(diǎn)樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動(dòng)。下行法展開(kāi)速度快要靠重力作用自上而下流動(dòng)。下行法展開(kāi)速度快，但，但RfRf值的重現(xiàn)性較差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散。值的重現(xiàn)性較差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散。 第14頁(yè)/共28頁(yè)第十五頁(yè)，共28頁(yè)。 (3) 環(huán)行法：又稱水平法，樣品點(diǎn)于圓形濾紙距圓心1cm左右的環(huán)形線(原線)上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向(fngxing)流動(dòng)。由于溶劑向圓周方向(fngxing)擴(kuò)散，所

14、以展開(kāi)的圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開(kāi)時(shí)，最好使用無(wú)方向(fngxing)性的特制濾紙。 （4）雙向展開(kāi)法：如果樣品組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分全部分開(kāi)時(shí)，可將樣品點(diǎn)在方形濾紙的一角，用一種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90o后再用另一種溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開(kāi)，這稱為“雙向展開(kāi)法”。 第15頁(yè)/共28頁(yè)第十六頁(yè)，共28頁(yè)。5.5.顯色顯色 為了顯示層析斑點(diǎn)位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，為了顯示層析斑點(diǎn)位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采用顯色劑顯示或紫外光顯示。采用顯色劑顯示或紫外光顯示。 (1) (1) 顯色劑顯示：顯色劑顯示： 被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色被分離物質(zhì)與顯色劑生成

15、有顏色的化合物，顯示斑點(diǎn)位置。常用噴霧法的化合物，顯示斑點(diǎn)位置。常用噴霧法 、浸漬、浸漬(jnz)(jnz)法法或涂刷法?；蛲克⒎?。 (2) (2) 紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會(huì)發(fā)出熒光，如維核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會(huì)發(fā)出熒光，如維生素生素B1B1、B2B2等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑點(diǎn)。的斑點(diǎn)。 6.6.定性分析定性分析 層析后的斑點(diǎn)顯示出來(lái)后，計(jì)算出各斑點(diǎn)的層析后的斑點(diǎn)顯示出來(lái)后，計(jì)算出各斑點(diǎn)的RfRf值，值，就可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性。就可以

16、對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性。 第16頁(yè)/共28頁(yè)第十七頁(yè)，共28頁(yè)。7.7.定量定量(dngling)(dngling)分析分析 對(duì)被分離的物質(zhì)進(jìn)行定量對(duì)被分離的物質(zhì)進(jìn)行定量(dngling)(dngling)的方法很多，的方法很多，常用的有：常用的有： (1) (1) 剪洗比色法：將斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摷粝幢壬ǎ簩唿c(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?，通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行比色定量后，通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行比色定量(dngling)(dngling)。 (2) (2) 直接比色法：用特制的分光光度計(jì)直接測(cè)量濾直接比色法：用特制的分光光度計(jì)直接測(cè)量濾紙上斑點(diǎn)顏色的濃度，畫(huà)出曲線，由曲線所包含的面積可紙上斑點(diǎn)顏色的濃度，畫(huà)出曲線，由曲線所包含的面積可求出待測(cè)物的含量。求出待測(cè)物的含量。 (3) (3) 面積測(cè)量法：實(shí)驗(yàn)證明，圓形或橢圓形斑點(diǎn)的面積測(cè)量法：實(shí)驗(yàn)證明，圓形或橢圓形斑點(diǎn)的面積與物質(zhì)含量的對(duì)數(shù)成正比。所以，可用測(cè)量斑點(diǎn)面積面積與物質(zhì)含量