氨基酸紙層析

1、2021-11-271實 驗 三氨基酸紙層析 學(xué)時：3 32021-11-272 1 1、通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)并掌握紙層 析的原理和操作技術(shù)； 2 2、掌握分配層析法； 3 3、掌握影響分配系數(shù)的因素。一、實驗?zāi)康模?021-11-273層析技術(shù)( (chromatography 色譜技術(shù)) )一、發(fā)展史：層析分離技術(shù)在2020世紀(jì)初就已得到應(yīng)用： 19031903年用于植物色素的分離, ,各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法” 19311931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體； 19441944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析； 2020世紀(jì)六十年

2、代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)(HPLC)。2021-11-274二、定義二、定義 層析技術(shù)層析技術(shù)是根據(jù)被分離的混合物中各組分的是根據(jù)被分離的混合物中各組分的理理化性質(zhì)化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相（一相為固定的，稱為相（一相為固定的，稱為固定相固定相；另一相流過固定；另一相流過固定相，稱為相，稱為流動相流動相）中進(jìn)行分配。）中進(jìn)行分配。 層析的基本概念2021-11-275 固定相固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，

3、離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液）。 流動相流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。 層析的基本概念2021-11-276三、層析技術(shù)的種類 1 1、按流動相的狀態(tài)分類： （1 1）液相層析（色譜） （2 2）氣相層析（色譜）； 2 2、按固定相的使用形式分類： （1 1）柱層析（2 2）紙層析（3 3）薄層層析； 3 3、按分離過程所主要依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)分類： （1 1）吸附層析 （2 2）分配層析 （3 3）離子交換層析 （4 4）凝膠層析 （5 5）親和層析等。2021-

4、11-277 紙層析法：是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。 濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附水作為固定相，通常把有機溶劑作為流動相。 將樣品點在濾紙上，進(jìn)行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進(jìn)行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動相移動的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來，形成距原點不等的層析點二、實驗原理: :2021-11-278分配層析法：分配層析法： 利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離目的的一種實驗方法。不同，而達(dá)到分離目的的一種實驗方法。 在一定條件下在一定條件下，一種物質(zhì)在某種溶

5、劑系統(tǒng)中的，一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)分配系數(shù)是一個常數(shù)是一個常數(shù)。 溶質(zhì)在溶質(zhì)在固定相固定相的濃度的濃度(Cs)(Cs)分配系數(shù)分配系數(shù)= 溶質(zhì)在溶質(zhì)在流動相流動相的濃度（的濃度（Cl)Cl)2021-11-279溶劑系統(tǒng)：溶劑系統(tǒng)： 正丁醇：甲酸：水正丁醇：甲酸：水=15=15：3 3：2 2 固定相固定相：水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成降低形成固定相固定相; ; 流動相流動相：有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細(xì)管中自：有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細(xì)管中自由流動，形成由流動，形成流動相。流動相。 由于混合

6、液中各種氨基酸的由于混合液中各種氨基酸的值不同，所以移動速率（即值不同，所以移動速率（即遷遷移率移率R Rf f值值）就不同，從而達(dá)到分離的目的。）就不同，從而達(dá)到分離的目的。2021-11-2710 移動速率移動速率( (比移值比移值) )： 原點到層析點中心的距離原點到層析點中心的距離 R Rf f = = 原點到溶劑前沿的距離原點到溶劑前沿的距離2021-11-27111 1、實驗材料：、實驗材料： 谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品2 2、儀器：、儀器： (1)(1)毛細(xì)管毛細(xì)管 (2)(2)電熱吹風(fēng)機電熱吹風(fēng)機 (3)(3)層析缸層析缸 (4)(

7、4)層析濾紙層析濾紙 (5)(5)小型玻璃噴霧器小型玻璃噴霧器(6)(6)鉛筆、直尺等。鉛筆、直尺等。3 3、試劑：、試劑： (1)(1)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、 組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。 (2)(2)溶劑系統(tǒng)：溶劑系統(tǒng)： 正丁醇：甲酸：水正丁醇：甲酸：水=15=15：3 3：2 2（體積比）搖勻；（體積比）搖勻； (3)(3)顯色劑：顯色劑：0.25%0.25%的茚三酮丙酮溶液。的茚三酮丙酮溶液。 三、實驗材料、儀器和試劑：2021-11-27122021-11-27131 1、樣品的準(zhǔn)備：、樣品的準(zhǔn)備： 稱取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸

8、、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各稱取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各1mg1mg混合溶混合溶于于10%10%異丙醇中，異丙醇中，0.01M0.01M。 2 2、濾紙的準(zhǔn)備：、濾紙的準(zhǔn)備： 取一長方形濾紙，在濾紙橫向?qū)?yīng)的兩邊，距邊沿取一長方形濾紙，在濾紙橫向?qū)?yīng)的兩邊，距邊沿2cm2cm處，處，各畫各畫兩條平行線兩條平行線，一條作，一條作前沿標(biāo)志前沿標(biāo)志，一條，一條作點樣線作點樣線，在點線上每，在點線上每隔隔2cm2cm畫一個畫一個“+”+”作為點樣位置，共作為點樣位置，共5 5個點。個點。四、實驗步驟： 2021-11-27142021-11-2715 3 3、點樣：、點樣： 用毛細(xì)管點樣，中間點混合

9、氨基酸，兩側(cè)點四種標(biāo)準(zhǔn)氨基用毛細(xì)管點樣，中間點混合氨基酸，兩側(cè)點四種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；每個，每點一次用晾干后再點下次，點樣點的直徑應(yīng)控制酸；每個，每點一次用晾干后再點下次，點樣點的直徑應(yīng)控制在在2mm2mm左點樣點重復(fù)點左點樣點重復(fù)點5 5次次右，點樣完畢用大頭針將濾紙做成右，點樣完畢用大頭針將濾紙做成筒筒形形，點樣面向外。，點樣面向外。 2021-11-27162021-11-27172021-11-27184 4、展層：、展層： 向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇驅(qū)游龈字屑尤雽游鋈軇?，液面不要超過點樣線液面不要超過點樣線，（高約，（高約1.5cm1.5cm，約，約50ml50ml溶劑）將濾紙點樣點朝下放

10、入層析溶劑中，將層溶劑）將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達(dá)標(biāo)志線后取出冷風(fēng)吹干。析缸密閉，待溶劑到達(dá)標(biāo)志線后取出冷風(fēng)吹干。5 5、顯色、顯色： 用噴霧器將用噴霧器將0.250.25茚三酮顯色劑茚三酮顯色劑均勻噴在濾紙上，熱風(fēng)（均勻噴在濾紙上，熱風(fēng)（加快反應(yīng)）反應(yīng)吹干顯色。加快反應(yīng)）反應(yīng)吹干顯色。2021-11-2719五、實驗結(jié)果與計算：五、實驗結(jié)果與計算： 1 1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；2 2、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算 各種已知氨基酸和未知氨基酸的各種已知氨

11、基酸和未知氨基酸的R Rf f值值。3 3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。 2021-11-27202021-11-2721Rf=X/Y2021-11-27222021-11-2723Rf=原點到層析中心的距離原點到層析中心的距離(a)原點到溶劑前沿的距離原點到溶劑前沿的距離(b)影響影響Rf值的因素：值的因素： 濾紙質(zhì)地和水飽和程度濾紙質(zhì)地和水飽和程度 物質(zhì)極性物質(zhì)極性 溶劑純度、溶劑純度、pH和含水量和含水量 層析溫度和時間層析溫度和時間 ab2021-11-2724氨基酸雙向紙層析2021-11-2725影響影響Rf值的主要因素：值的主要因素： R Rf

12、 f決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系數(shù)不同，質(zhì)分配系數(shù)不同，R Rf f也就不同。也就不同。（1 1）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性：）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性： 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配系數(shù)，極性大的易溶于水中即固定相中，的分

13、配系數(shù)，極性大的易溶于水中即固定相中，R Rf f??；反之小；反之,R,Rf f則較大。則較大。2021-11-2726（2 2）層析溶劑：）層析溶劑： 首先，溶劑的純度要高。首先，溶劑的純度要高。 其次，溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的其次，溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的R Rf f在在0.050.050.850.85。 再次，溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制，如正丁醇再次，溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制，如正丁醇- - 甲酸甲酸- -水系統(tǒng)久水系統(tǒng)久放易引起酯化。放易引起酯化。 （3 3）pHpH值： 溶劑、濾紙和樣品的pHpH值都會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使RfR

14、f改變； 2021-11-2727（4 4）濾紙：）濾紙： 層析濾紙由高純度棉花制成，層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，要被溶劑所飽和。不同型號的濾紙，其厚機械強度，要被溶劑所飽和。不同型號的濾紙，其厚薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結(jié)合薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結(jié)合水的量不一樣，兩相的體積比也就不同，水的量不一樣，兩相的體積比也就不同，R Rf f也不同；也不同； 另外，濾紙的雜質(zhì)也會影響另外，濾紙的雜質(zhì)也會影響R Rf f，必要時進(jìn)行預(yù)處，必

15、要時進(jìn)行預(yù)處理（可用理（可用0.010.010.4M0.4M的的HClHCl處理除去金屬離子）處理除去金屬離子）. . 2021-11-2728（5 5）室驗室的溫度和時間）室驗室的溫度和時間: : 溫度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響溫度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用從而影響也影響濾紙纖維的水合作用從而影響固定相的體積固定相的體積；也影響溶劑系；也影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例。層層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。析必須在恒溫條件下進(jìn)行。 2021-11-2729（6 6）展開方式：）展開方式： 上行法上行法R Rf f小；??；下行法下行法（層析缸上部有一盛展開劑（層析缸上部有一盛展開劑的液槽，濾紙點樣端向上進(jìn)入槽中，重現(xiàn)性差，斑點的液槽，濾紙點樣端向上進(jìn)入槽中，重現(xiàn)性差，斑點易擴散）易擴散） R Rf f