免疫學(xué)檢驗(yàn) 整理

1、鍵入公司名稱免疫學(xué)檢驗(yàn)整理鍵入文檔副標(biāo)題Administrator選取日期免疫學(xué)檢驗(yàn)第一章緒論免疫學(xué)檢驗(yàn)（immunoassay）：免疫學(xué)檢驗(yàn)是研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域中的一門應(yīng)用學(xué)科： 免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展歷史：1、 經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)發(fā)展階段 （1618世紀(jì)）接種人痘（中國）/牛痘（英國）預(yù)防天花2、經(jīng)典免疫學(xué)發(fā)展階段（19世紀(jì)后期） 凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等免疫學(xué)方法被大量運(yùn)用于臨床 肥達(dá)反應(yīng)：1896年Widal用傷寒患者血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集反應(yīng)來診斷傷寒3、近現(xiàn)代免疫學(xué)發(fā)展階段（20世紀(jì)初） - Landsteiner的血型研究，開拓了免疫化學(xué)領(lǐng)域Karl La

2、ndsteiner(1868-1943)發(fā)現(xiàn)ABO血型Burner的克隆選擇學(xué)說（clone selection theory)預(yù)見了一個細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體 - Kohler和Milstein于1975年創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)20世紀(jì)6070年代，諸多免疫標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用：放射標(biāo)記免疫、酶標(biāo)記免疫、熒光標(biāo)記免疫、金（銀）標(biāo)記免疫、免疫印跡 - 免疫學(xué)檢測的水平從mg提高到pg，檢測范圍從病原微生物擴(kuò)大到多種物質(zhì)免疫學(xué)檢驗(yàn)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定、簡便、快速免疫學(xué)檢驗(yàn) 細(xì)胞免疫檢驗(yàn)：免疫活性細(xì)胞及其功能的檢測 體液免疫檢驗(yàn)：抗原、抗體、補(bǔ)體等的檢測免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用范圍：Ø

3、 傳染?。貉鍖W(xué)檢測病原微生物及其代謝產(chǎn)物Ø 免疫性疾病：青霉素注射前的皮試Ø 腫瘤抗原、抗腫瘤抗體、腫瘤標(biāo)志物Ø 組織器官移植：肝臟移植前的HLA配型Ø 血型和血液病：輸血前的ABO及Rh配型Ø 其他：樣品中微量的酶、激素、蛋白質(zhì)、藥物等免疫學(xué)檢驗(yàn)的基本原理A與B相互識別構(gòu)象，產(chǎn)生應(yīng)答 抗原 抗體細(xì)胞因子受體補(bǔ)體抗原抗體復(fù)合物通過某種方法檢測到A與B的識別反應(yīng) 直接觀察：沉淀、凝集通過標(biāo)記：熒光、放射線、吸光值免疫學(xué)檢驗(yàn)的一般思路1、選擇合適的檢驗(yàn)方法Ø 檢驗(yàn)的靈敏度Ø 檢驗(yàn)的特異度Ø 方法的可行性2、對檢驗(yàn)結(jié)果

4、進(jìn)行評價Ø 陽性結(jié)果說明什么？陰性結(jié)果說明什么？Ø 檢驗(yàn)的重復(fù)性Ø 是否設(shè)立對照？ Ø 檢驗(yàn)過程的質(zhì)量控制很重要！目前常用的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)l 凝集反應(yīng)l 沉淀反應(yīng)l 補(bǔ)體測定和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)l 熒光免疫技術(shù)l 酶免疫技術(shù)l 放射免疫技術(shù)l 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)l 金（銀）免疫技術(shù)l 免疫細(xì)胞檢測各種免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的比較免疫系統(tǒng) 是脊椎動物和人類的防御系統(tǒng)。它與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等一樣，是機(jī)體的一個重要系統(tǒng)。 機(jī)體的“安全部門”免疫系統(tǒng)的組成:免疫器官 免疫系統(tǒng)的功能：免疫防御病原體的入侵 免疫細(xì)胞 免疫穩(wěn)定對衰亡死亡損傷的細(xì)胞的清除 免疫分子 免疫

5、監(jiān)視對突變細(xì)胞的清除免疫細(xì)胞發(fā)生分化發(fā)育成熟的場所免疫器官：中樞免疫器官 骨髓“士兵工廠” TB細(xì)胞的發(fā)源地、B細(xì)胞成熟場所胸腺“訓(xùn)練場” T細(xì)胞成熟場所外周免疫器官 脾血液過濾器免疫細(xì)胞定居、應(yīng)答的場所 淋巴結(jié)小戰(zhàn)場 黏膜相關(guān)淋巴組織參與局部免疫應(yīng)答 扁桃 咽喉守衛(wèi)者 腸相關(guān)淋巴組織 腸道守護(hù)者 闌尾 免疫助手經(jīng)抗原刺激后產(chǎn)生免疫細(xì)胞 適應(yīng)性免疫細(xì)胞 T細(xì)胞 TH TS TC或CTL接上與生具有，先天的固有免疫細(xì)胞 M0 DC NK細(xì)胞間信息交流免疫分子 免疫球蛋白 特異性結(jié)合抗原，激活補(bǔ)體，F(xiàn)c段結(jié)合Fc受體的作用補(bǔ)體 溶解靶細(xì)胞，免疫調(diào)節(jié)抗細(xì)菌抗腫瘤調(diào)節(jié)免疫刺激造血 細(xì)胞因子 白介素IL

6、 腫瘤壞死因子TNF 干擾素IFN 集落刺激因子CSF 趨化因子生長因子GF 膜分子免疫細(xì)胞間相互識別第二、三章 抗原-抗體反應(yīng)及抗原抗體的制備免疫器官： 中樞免疫器官：骨髓 胸腺 外周免疫器官：淋巴結(jié) 脾臟 粘膜免疫系統(tǒng)免疫細(xì)胞：T淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞 抗原提呈細(xì)胞 粒細(xì)胞 紅細(xì)胞 肥大細(xì)胞 免疫分子：可溶性分子：抗體 補(bǔ)體 細(xì)胞因子 膜分子：CD分子 黏附分子 主要組織相容性抗原第一節(jié) 抗原和抗體抗原 antigen，Ag刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，也稱免疫原?？乖男阅?、免疫原性 immuno

7、genicity 抗原刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力2、免疫反應(yīng)性 immunoreactivity 抗原可與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的能力，也稱抗原性抗原的種類完全抗原：既有免疫原性又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)，如各種微生物、大多數(shù)蛋白質(zhì)不完全抗原：只有免疫反應(yīng)性而沒有免疫原性的物質(zhì)，如多糖，簡單小分子等，也稱半抗原 hepten 耐受原：可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性無應(yīng)答狀態(tài)，形成免疫耐受的抗原，稱耐受原 tolerogen 變應(yīng)原：可刺激機(jī)體發(fā)生過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，發(fā)生超敏反應(yīng)的抗原，稱為變應(yīng)原 allergen影響抗原免疫原性的因素抗原因素：1、抗原異質(zhì)性 foreig

8、nness 異種物質(zhì)、同種異體物質(zhì)、自身物質(zhì)2、抗原分子的理化性質(zhì)分子量大小、化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)、分子構(gòu)象與易接近性 conformation & accessibility應(yīng)用 抗原與抗體之間的種屬關(guān)系越遠(yuǎn)，組織結(jié)構(gòu)差異越大，異質(zhì)性越強(qiáng)宿主因素：1、宿主的遺傳背景、年齡、性別、健康狀況等2、抗原的劑量及進(jìn)入機(jī)體的途徑應(yīng)用 - 選用遺傳背景合適、健康年輕的動物個體作為宿主- 抗原劑量要適中，根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)拿庖叻椒?，一般皮?nèi)注射免疫原性最佳，口服免疫原性最差常見的抗原l 微生物及其代謝產(chǎn)物l 類毒素免疫動物后的動物免疫血清（含抗毒素）l 異嗜性抗原 不同種屬間的共同抗原l 同種異型抗原

9、紅細(xì)胞表面的血型抗原，MHC抗原l 其他抗原 腫瘤抗原、人工合成抗原。非特異性免疫刺激劑超抗原 superantigen ：某些物質(zhì)可以非特異性地激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，稱為超抗原。如金葡菌腸毒素、金葡菌A蛋白（SPA）等。有絲分裂原 mitogen ：可非特異性地激活淋巴細(xì)胞進(jìn)行分裂克隆的物質(zhì)，稱為有絲分裂原，簡稱絲裂原。如刀豆蛋白A、植物血凝素PHA、細(xì)菌脂多糖LPS、SPA等抗原特異性 是指物質(zhì)之間的相互吻合性、針對性或?qū)Ｒ恍浴 抗原的特異性表現(xiàn)在兩個方面:(1) 免疫原性的特異性(2)抗原性的特異性。l 特異性是免疫應(yīng)答最重要的特點(diǎn)，也是免疫學(xué)診斷與防治的理論依據(jù)。l 決定

10、抗原特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原分子中的抗原決定簇(antigenic determinant),又稱表位(epitope)抗原決定簇（抗原表位）: l 指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。是被免疫細(xì)胞TCR/BCR識別的靶結(jié)構(gòu)，是抗原物質(zhì)特異性的分子學(xué)基礎(chǔ)。l 也是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)組成為：l 一個多肽決定簇含515個氨基酸殘基；l 一個多糖決定簇含57個多糖殘基；l 一個核酸半抗原決定簇含68個核苷酸。抗原決定簇（表位）的類型(1)順序決定簇(sequential determinant)-線性表位(linear epitope)(2)構(gòu)像決定簇(conforma

11、tionl determinant)-非線性表位( non-linear epitope)(3)T細(xì)胞決定簇 : T細(xì)胞決定簇位于抗原分子任何部，必須由APC將抗原加工處理為小分子多肽并與MHC分子結(jié)合，然后才能被TCR所識別。識別的是線形表位(順序決定簇)(4)B細(xì)胞決定簇:(半抗原決定簇)BCR能與未經(jīng)APC加工的抗原發(fā)生反應(yīng)，其識別的靶結(jié)構(gòu)主要位于抗原分子表面的決定簇。線形表位和構(gòu)像性表位T細(xì)胞B細(xì)胞抗原表位的特性比較抗原結(jié)合價:是指抗原分子表面能與抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)，稱為(antigenic valence)共同抗原與交叉反應(yīng) 兩種不同的抗原具有相同或相似的抗原決定簇，則稱

12、為共同抗原或交叉抗原?？乖ɑ蚩贵w）除與其相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)外，有時還可與其他抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)（cross-reaction）。交叉反應(yīng)是建立在兩種不同的抗原具有相同或相似的抗原表位的基礎(chǔ)上的，這種表位叫共同抗原表位（common epitope）l 抗體 antibody，Ab 免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，合成并分泌能與抗原特異性結(jié)合的球蛋白舊稱：球蛋白/丙種球蛋白 l 免疫球蛋白 immunoglobulin，Ig 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白。血清和細(xì)胞外液中含量最高、在免疫應(yīng)答中起主要作用的是IgG?？贵w是

13、Ig，但I(xiàn)g并不都是抗體！人體的5種抗體Ig也具有免疫原性l 同種型 isotype ： 同種屬特異性的共有抗原表位結(jié)構(gòu)l 同種異型 sllotype ：同種屬不同個體間的抗原表位結(jié)構(gòu)l 獨(dú)特型 idiotype： 同一個體內(nèi)，不同B細(xì)胞產(chǎn)生的不同Ig分子應(yīng)用：- 抗體的制備，單克隆抗體的制備一抗和二抗l 抗原接種于人或動物，機(jī)體產(chǎn)生的抗體，在試驗(yàn)中常稱為第一抗體，簡稱一抗/Ab1l 利用免疫球蛋白Ig的同種型抗原特異性，將人Ig接種于動物，或動物Ig接種異種動物，可制備出抗抗體，又稱第二抗體，簡稱二抗/Ab2應(yīng)用：抗原-抗體反應(yīng) antigen-antibody reaction 抗原和相應(yīng)

14、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)抗原-抗體反應(yīng)可發(fā)生在體內(nèi)（in vivo），也可發(fā)生在體外（in vitro）體內(nèi)：吞噬、溶菌、中和。體外：凝集、沉淀、溶菌、溶血、中和。抗原-抗體反應(yīng)是免疫學(xué)檢驗(yàn)最常用的檢驗(yàn)原理！抗原-抗體反應(yīng)的原理l 抗原-抗體間通過非共價鍵作用結(jié)合 靜電引力、范德華力、氫鍵、疏水作用l 抗原-抗體間的親和力affinity和親合力avidity 親和力：抗原表位抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，是內(nèi)在的 親合力：抗原-抗體的結(jié)合強(qiáng)度，是整體的穩(wěn)定性 親合力與內(nèi)在親和力、抗體結(jié)合價、抗原和抗體的立體結(jié)構(gòu)都有關(guān)系，是免疫化學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵l 抗原-抗體結(jié)合后，電子云消失，親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗原抗體反

15、應(yīng)的特點(diǎn) 1、特異性 specificity 一種抗原只能與相應(yīng)的抗體結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，這種特異性源自于抗原-抗體之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性1、互補(bǔ)性與親和性應(yīng)用：- 具有相似抗原表位的物質(zhì)，可與抗體構(gòu)型部分吻合，產(chǎn)生交叉反應(yīng)(cross reaction) 檢驗(yàn)中使用的抗原或抗體制劑需要提純、鑒定- 檢測中讓抗原抗體能充分接觸，相互識別2、比例性 proportionality抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需要一定的量比關(guān)系應(yīng)用：檢測時要注意抗原抗體的濃度比適中問題：怎么確定最適濃度？3、可逆性 reversibility抗原抗體結(jié)合成復(fù)合物，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體解離決定因素： - 抗體對

16、相應(yīng)抗原的親和力 - 環(huán)境因素對抗原-抗體復(fù)合物的影響，如pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)用：- 檢測時保證抗原-抗體反應(yīng)處于合適的緩沖環(huán)境- 可通過改變pH值或離子強(qiáng)度來純化抗原、抗體 影響抗原-抗體反應(yīng)的因素一、反應(yīng)物自身因素1、抗原：理化特性、抗原表位的種類及數(shù)目等如 可溶性抗原抗體：沉淀 顆粒性抗原抗體：凝集2、抗體： - 來源：不同動物的免疫血清等價帶不同，反應(yīng)性能也有差異 - 濃度：最適比，試驗(yàn)中需進(jìn)行抗體預(yù)滴定 - 特異性和親和力：最重要的影響因素 免疫動物早期免疫血清特異性高但親和力低，后期抗血清親和力提高但特異性下降 二、反應(yīng)環(huán)境條件1、電解質(zhì)：- 0.85% NaCl溶液（0.15 mo

17、l/L）使抗原-抗體復(fù)合物形成可見沉淀或凝集- 高濃度電解質(zhì)會造成非特異性蛋白質(zhì)沉淀，即鹽析2、酸堿度： - 抗原-抗體反應(yīng)最適pH值為69，有補(bǔ)體參與時為pH7.27.4- pH3左右接近細(xì)菌抗原的等電點(diǎn)，會引起細(xì)菌的自身凝集，即非特異性酸凝集，造成假陽性3、溫度一般為1540，最適374、其他因素 - 適當(dāng)振蕩可促進(jìn)抗原、抗體接觸，劇烈振蕩會造成抗原-抗體復(fù)合物解離 - 其他蛋白質(zhì)、多糖存在，會抑制抗原-抗體反應(yīng)，或造成非特異性結(jié)合試驗(yàn)中須注意實(shí)驗(yàn)條件的選擇和穩(wěn)定，做好嚴(yán)格的對照，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性！抗原和抗體的制備技術(shù)是免疫學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)自學(xué)內(nèi)容：抗原抗體的純化方法離心分離法、鹽析法、

18、有機(jī)溶劑沉淀法、凝膠層析法、離子交換法、親和層析法、電泳 了解各種方法的基本原理、優(yōu)缺點(diǎn)、主要應(yīng)用抗原的制備一、顆粒性抗原的制備1、細(xì)胞抗原2、細(xì)菌抗原不同種類細(xì)菌抗原的制備l 菌體抗原（O抗原）：100水浴22.5 h殺菌并破壞鞭毛，加入苯酚至終濃度為5%l 鞭毛抗原： 選用有動力的菌株，菌液用0.3%0.5%的甲醛溶液處理l 毒素抗原（表面抗原，Vi、K抗原）： 沸水浴殺菌后，加入0.5%1%的CaCl2溶液l 菌液濃度的測定ü Mc Farland標(biāo)準(zhǔn)比濁法：與1%硫酸溶液和1%氯化鋇溶液比濁ü 稀釋平板計(jì)數(shù)法：配置系列10倍稀釋菌液，涂布平板或點(diǎn)10L樣點(diǎn) 

19、2; 生長曲線估算：E. Coli 在LB培養(yǎng)液中，37 培養(yǎng)過夜達(dá)到生長靜息期，濃度約為109 cfu/mL 二、可溶性抗原的制備l 制備可溶性抗原時需先破碎組織和細(xì)胞，然后再提取所需的目的成分，如蛋白質(zhì)、核酸等 組織破碎：l細(xì)胞破碎：細(xì)胞可來自于機(jī)械搗碎的組織，或培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化 超聲破碎法：間隔進(jìn)行，超聲1 min，冰浴1 min，總時間為1015 min 冷熱交替法：90 水浴數(shù)分鐘，冰浴迅速冷卻，反復(fù)進(jìn)行，可提取病毒蛋白或核酸 反復(fù)凍融法：- 20 凍存，室溫融化，反復(fù)進(jìn)行 表面活性劑處理：SDS, 苯扎溴銨等l 蛋白質(zhì)純化：超速離心、鹽析、凝膠層析、離子交換層析、親和層析

20、Ig片段可通過酶裂解、氧化/還原斷裂二硫鍵等方法制備l 核酸提取：酚/氯仿去除蛋白，乙醇/異丙醇沉淀l 脂多糖制備：苯酚處理菌液，對上層水相透析除酚、濃縮、超速離心 3、純化抗原的鑒定l 抗原鑒定一般包括理化性質(zhì)、濃度、純度、免疫活性等，需多種方法聯(lián)用鑒定l 相對分子量：SDS-PAGEl 蛋白濃度：分光光度計(jì)測OD280l 免疫活性：雙向瓊脂擴(kuò)散法l 純度：免疫電泳人工結(jié)合抗原 半抗原 偶聯(lián)橋 載體蛋白半抗原：能與對應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng) 、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特異結(jié)構(gòu)的化學(xué)活性基團(tuán)物質(zhì)（

21、如青霉素、磺胺劑等 ） ，稱為簡單半抗原。 半抗原載體蛋白：制作人工結(jié)合抗原時與半抗原進(jìn)行偶聯(lián)的具有免疫原性的生物大分子，主要為大分子的蛋白質(zhì)。如：牛血清白蛋白(BSA)。 1、選擇合適的多肽序列，蛋白質(zhì)的抗原決定簇一般由6-12個氨基酸構(gòu)成，呈連續(xù)性或者非連續(xù)性序列。 確定抗原區(qū)域性2、抗原決定簇大部分為親水性基團(tuán)，暴露在外側(cè)，抗原決定簇柔韌性比較高。 親水性、表露性、 柔韌性 3、制備性抗原地多肽有效長度一般是10-20個氨基； 334Da 半抗原的分子量 374Da 制備的單克隆抗體具有很高的親和系數(shù)。 300Da 產(chǎn)生具有良好靈敏度和特異性單克隆抗體的可能性下降確定多肽的長度 人工抗原

22、合成常用的載體載體的特點(diǎn)載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán)。 載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠的分子。 載體應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能。 載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)該是廉價易得的。 牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等是常用的載體蛋白。蛋白偶聯(lián)方法通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合，不宜在高溫、低溫、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸條件下進(jìn)行。 一般是由半抗原上的活性基團(tuán)決定偶聯(lián)合成的方法。所有的偶聯(lián)方法都應(yīng)該是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。 蛋白偶聯(lián)方法l 分子中含有羧基或者可羧化的

23、半抗原的偶聯(lián) l 混合酸酐法（mixed anhydride method），又稱氯甲酸異丁酯法 正丁胺 -COOH- 中間體+NH3+ 結(jié)合產(chǎn)物 +氯甲酸異丁酯 l 碳二亞胺法(EDC)l l 含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián) l 戊二醛法 -N=C< （schiff鍵） l 重氮化法 （用于活性基團(tuán)是芳香胺基的半抗原） 芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮鹽 l 含羥基半抗原的偶聯(lián) l 琥珀酸酐法 -OH-+琥珀酸酐 無水吡啶 帶有羧基的中間體 EDC法或混合酸酐法 結(jié)合產(chǎn)物 l 羰基二咪唑法（CDI） N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性試劑 免疫血清的制備l 免疫血清：也稱抗血清

24、，是抗原接種動物后，取其血清制成，含有已知抗原的特異性抗體l一、免疫動物的選擇制備抗血清常用哺乳類和禽類，如綿羊、兔子、豚鼠、雞、山羊、馬等選擇的原則：1. 抗原與免疫動物種屬差異越大，免疫原性越好2. 須選擇適齡、健康、SPF級的動物3. 根據(jù)抗血清需要量大小選擇不同體型動物4. 根據(jù)所用抗原的性質(zhì)選擇不同種屬動物蛋白質(zhì)抗原家兔、山羊，細(xì)菌馬、家兔，酶豚鼠二、免疫方法的確定l 抗原的注射劑量和間隔時間 綜合考慮抗原的免疫原性、動物的個體狀態(tài)、佐劑種類，通過預(yù)試驗(yàn)確定合適劑量與間隔時間 - 第一次接種適量宜小，避免免疫耐受 - 以后接種劑量適當(dāng)增加，提高抗體效價 - 首次免疫后，間隔720 d

25、接種第二次，避免免疫耐受，之后間隔710 d，防止抗體效價下降l 免疫途徑 - 皮內(nèi)、皮下一般多點(diǎn)注射 - 腹腔、靜脈注射常用于顆粒性抗原免疫 - 寶貴抗原可淋巴結(jié)內(nèi)微量注射免疫佐劑 immunoadjuvant：簡稱佐劑，是非特異性的免疫增強(qiáng)劑，可先于抗原注入機(jī)體、或與抗原一起注射，能增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變免疫應(yīng)答的類型佐劑的作用機(jī)制l 增強(qiáng)抗原的免疫原性：改變抗原物理性質(zhì)、降低分解速度、延長抗原的作用時間l 活化細(xì)胞膜，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對抗原的有效處理l 直接或間接激活免疫活性細(xì)胞、增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能常用佐劑的種類有免疫原性：卡介苗、百日咳桿菌、結(jié)合分枝桿菌無免疫原性：氫

26、氧化鋁、磷酸鈣、液體石蠟、表面活性劑弗氏佐劑：不完全弗氏佐劑油劑（液體石蠟/花生油）+ 乳化劑（羊毛脂/吐溫-80）2： 1完全弗氏佐劑不完全弗氏佐劑+卡介苗（220 mg/mL）將抗原和弗氏佐劑按11充分混合成乳劑使用佐劑的應(yīng)用原則l 免疫原性較強(qiáng)的抗原不需要使用佐劑，如顆粒性抗原l 可溶性抗原初次免疫必須使用佐劑l 完全弗氏佐劑會引起局部炎癥反應(yīng)，不應(yīng)連用l 佐劑應(yīng)該應(yīng)該無毒性無副作用免疫失敗的可能原因l 免疫動物的種屬及品系不合適l 制備的免疫原不合適l 所用的佐劑不合適或使用有誤l 免疫的方法不合適l 動物的飼養(yǎng)不符合要求為避免失敗，應(yīng)嚴(yán)格遵守已有的試驗(yàn)操作步驟（protocol）進(jìn)行

27、，不應(yīng)隨便更改細(xì)則抗血清采集l 頸動脈放血法 綿羊、山羊、家兔l 心臟采血法 家兔、大鼠、豚鼠、雞等小動物l 靜脈多次采血法l 小鼠還可采用眼球摘除或斷尾采血l 注意對試驗(yàn)動物的人道處理！抗血清的鑒定、純化與保存l 抗血清的分離 - 離心法最常用 - 采集血液室溫自然凝固后，37放置1h，4過夜，血塊收縮后即可分離血清 - 某些血清在分離后需經(jīng)56處理30min，以滅活補(bǔ)體l 抗血清的鑒定 1、雙向免疫擴(kuò)散法鑒定特異性抗體 2、雙向免疫擴(kuò)散法測定抗體效價 3、SDS-PAGE可測定抗體的純度l 抗血清的純化：去除其他非特異性成分單價特異性抗體純化抗血清不純的原因：1、免疫原不純，出現(xiàn)雜抗體2、

28、出現(xiàn)抗重鏈雜抗體或抗輕鏈雜抗體3、某些蛋白總與其他蛋白結(jié)合出現(xiàn)純化方法：1、親和層析法：雜抗原與Sepharose 4B層析柱交聯(lián)，將抗血清過柱，其他雜抗體被吸附，特異性抗體被洗脫2、吸附法：非特異性抗原與戊二醛制成固相吸附劑，加入抗血清，雜抗體與雜抗原結(jié)合，特異性抗體則存在于上清中特異性IgG抗體的純化l 硫酸銨鹽析法： 經(jīng)多次鹽析得到蛋白沉淀，復(fù)溶后透析除鹽，可粗提取- 球蛋白l 親和層析法： 制備SPA-Sepharose 4B層析柱，IgG先與SPA結(jié)合，然后被洗脫l 離子交換柱法：抗血清過QAE-Sephadex柱l 凝膠過濾法：多孔凝膠分離不同大小蛋白l 酶解法： 胃蛋白酶或木瓜蛋

29、白酶制備F（ab)2和Fab片段l 抗血清的保存 純化后的抗血清需進(jìn)行過濾除菌，或用0.1%0.2%的NaN3溶液防腐，分裝保存 - 4可存放3個月到半年 - 2070可保存5年- 真空干燥后， 4可存放510年單克隆抗體的制備單克隆抗體 monoclonal antibody， McAb 由一個B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，只針對某一特定的抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體，由于來源于同一細(xì)胞系，單克隆抗體具有均一的特異性，其Ig的類、亞類、型都是均一的。1975年，Kohler和Milstein采用細(xì)胞融合技術(shù)，得到了B細(xì)胞雜交瘤，從而在體外培養(yǎng)制備出了McAb。McAb的制備技術(shù)要點(diǎn):l 用人工的

30、方法將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤 - B 細(xì)胞可從抗原免疫過的小鼠脾臟中獲得 - 骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備以下條件：1. 與B細(xì)胞有較高的融合率2. 本身不合成Ig 3. 與B細(xì)胞融合后能形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞4. 缺乏HGPRT酶（次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶）5. 穩(wěn)定、容易培養(yǎng)McAb的制備流程1、 用抗原對小鼠進(jìn)行免疫，獲得分泌特異性抗體的小鼠B細(xì)胞，同時培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞2、 兩種細(xì)胞混合后加入融合劑聚乙二醇PEG，融合形成小鼠B細(xì)胞雜交瘤。B細(xì)胞雜交瘤既有腫瘤細(xì)胞無限增值的特性，又有B細(xì)胞合成分泌特異性抗體的特性3、 用HAT培養(yǎng)基對融合過程后的細(xì)胞進(jìn)行篩選篩選原理：- HAT培養(yǎng)

31、基含H、A、T三種核苷酸- A的存在抑制糖、氨基酸等分子合成核苷酸；在HGPRT和其他轉(zhuǎn)化酶的作用下，可催化H和T合成所需核苷酸- 骨髓瘤細(xì)胞不含HGPRT酶，因此不能在HAT培養(yǎng)基上存活；離體的B細(xì)胞也不能存活；只有融合后的B細(xì)胞雜交瘤可以存活4、 對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，選出正確表達(dá)所需特異性抗體的高分泌性雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行克隆化擴(kuò)增，以大量制備McAb- 篩選方法一般采用ELISA- 擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞可采用體外培養(yǎng)，或注入小鼠腹腔，也可從腹水中獲得大量單克隆雜交瘤細(xì)胞- 雜交瘤細(xì)胞容易發(fā)生染色體丟失，失去分泌抗體的能力，因此篩出陽性克隆后，須盡快保種McAb的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：Ø 結(jié)構(gòu)高度均一

32、，特異性強(qiáng)，效價高，少有交叉反應(yīng)Ø 可大量生產(chǎn)，且穩(wěn)定好缺點(diǎn)：Ø 鼠源McAb對人是異種抗原，可能引起超敏反應(yīng)現(xiàn)代基因工程可對編碼Ig的基因進(jìn)行修飾，直接合成所需的抗體小結(jié)l 抗原抗體特異性結(jié)合是免疫學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)原理l 抗原抗體反應(yīng)受多因素影響，因此必須注意試驗(yàn)條件，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠l 純化的抗原可用于診斷試驗(yàn)或制備抗血清l 抗血清中含有特異性抗體，經(jīng)過純化、鑒定后，可用于檢測、鑒定抗原l 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體是免疫學(xué)技術(shù)的一大突破三凝集實(shí)驗(yàn)抗原-抗體反應(yīng)分為兩個階段 特異性結(jié)合階段：抗原和抗體迅速識別、結(jié)合 可見反應(yīng)階段：受電解質(zhì)、酸堿度、溫度等環(huán)境因素影響

33、，發(fā)生凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的溶血等可見現(xiàn)象，反應(yīng)慢凝集反應(yīng) agglutination 顆粒性抗原，或與載體顆粒結(jié)合后的可溶性抗原（或抗體），與抗體（或抗原）結(jié)合后，在適當(dāng)條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。參與反應(yīng)的抗原稱凝集原，抗體稱凝集素。凝集反應(yīng)：直接凝集反應(yīng) 間接凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)的影響因素l 電解質(zhì)：0.85% NaCl溶液，降低顆粒性抗原的電荷l pH值： 合適pH值為68，pH在3左右出現(xiàn)細(xì)菌的自凝現(xiàn)象，稱為酸凝l 溫度：過冷反應(yīng)速度慢，過熱破壞蛋白結(jié)構(gòu)l 抗體與抗原的比例 什么現(xiàn)象？ 一、直接凝集試驗(yàn)顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝

34、集現(xiàn)象1、玻片法簡便、快速的定性試驗(yàn)，敏感度低 如：人類ABO血型鑒定，細(xì)菌分離株的鑒定與分型2、試管法半定量試驗(yàn)：了解抗體及其含量 二、間接凝集試驗(yàn)將可溶性抗原吸附或偶聯(lián)在大小適當(dāng)、與免疫無關(guān)的載體微粒上，制成致敏顆粒，再與相應(yīng)的抗體作用，在適宜電解質(zhì)存在時，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，也稱被動凝集試驗(yàn) 致敏： 將可溶性抗原吸附或偶聯(lián)到載體微球上的過程稱為致敏，致敏后的載體微球稱為致敏微球。致敏后的顆粒反應(yīng)面積增加，敏感性提高。 載體微球的條件1、不溶于水，理化性質(zhì)穩(wěn)定，無化學(xué)活性和免疫學(xué)活性2、大小均勻一致，密度與生理鹽水等介質(zhì)相近，短時間內(nèi)不致下沉3、可直接吸附或偶聯(lián)結(jié)合抗原或抗體，且不影響其特

35、性致敏所用的抗原或抗體需要純度高，且免疫活性較好常用載體：紅細(xì)胞：綿羊、家兔、雞紅細(xì)胞，人O型血紅細(xì)胞Ø 吸附多糖抗原較好，吸附蛋白抗原較差Ø 使用前醛化，可增強(qiáng)吸附蛋白的能力，能耐60加熱，可長期保存不溶血。且延長保存期，不易溶血聚苯乙烯膠乳顆粒：人工合成顆粒，帶負(fù)電Ø 物理方法吸附蛋白，但結(jié)合牢固性較差Ø 羧化后，帶化學(xué)活性基團(tuán)，可化學(xué)交聯(lián)蛋白，性能穩(wěn)定，保存期長間接凝集反應(yīng)的類型1、正向間接凝集試驗(yàn) 用已知抗原致敏載體顆粒，檢測樣本中的抗體。常用于檢測病原微生物相關(guān)的抗體2、反向間接凝集試驗(yàn) 用已知抗體致敏載體顆粒，檢測樣本中的抗原?？蓹z測新型隱球

36、菌莢膜抗原，乙肝表面抗原等3、間接凝集抑制試驗(yàn) 用已知抗原致敏載體顆粒，檢測樣本中是否含有相同的抗原（正向）。亦可用已知抗體致敏載體顆粒，檢測樣本中是否含有同樣的抗體（反向）。4、間接血凝試驗(yàn)（IHA）：是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)血凝試驗(yàn) 可在微量滴板或試管中進(jìn)行，將倍比稀釋的標(biāo)本滴一滴到V形板孔中，同時設(shè)一空白孔，再滴入一滴0.5%致敏RBC懸液，混勻，室溫靜置1-2h。 結(jié)果： RBC沉積孔底，集中于一圓點(diǎn)為陰性 RBC凝集，分布孔底周圍，可根據(jù)凝集程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以+為滴度終點(diǎn)。5、膠乳凝集試驗(yàn)（LAT）一種以聚苯乙烯膠乳為載體顆粒的間接凝集反應(yīng)。通過物理吸附、化學(xué)交聯(lián)的方

37、式結(jié)合蛋白質(zhì)抗原/抗體分為試管法和玻片法膠乳為人工合成的載體，性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定，均一性好，但與蛋白質(zhì)結(jié)合能力以及聚集性能不如紅細(xì)胞，因此作為間接凝集反應(yīng)，膠乳凝集的敏感度不及血凝試驗(yàn)。 6、協(xié)同凝集試驗(yàn)用金葡菌作為載體，其表面A蛋白（SPA）可與IgG的Fc非特異性結(jié)合，可看做IgG致敏的金葡菌，檢測樣本中與IgG結(jié)合的抗原?？捎糜诩?xì)菌的快速鑒定和分型，細(xì)菌中和病毒等可溶性抗原的測定。7、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 抗人O型紅細(xì)胞抗體：能與各種血型的紅細(xì)胞結(jié)合，但不引起凝集反應(yīng) 將特異性抗原（抗體）與抗O型紅細(xì)胞抗體連接，檢測全血樣本中特異性結(jié)合的抗體（抗原） 待測標(biāo)本：全血凝集反應(yīng)的特點(diǎn)l 凝集反應(yīng)

38、所用的抗原是較大的顆粒性物質(zhì)，在介質(zhì)中分散成均勻的顆粒懸液l 反應(yīng)所形成的凝集物主要由抗原物質(zhì)組成l 由于抗原顆粒大，反應(yīng)表面積相對較小，為防止抗體過量，試驗(yàn)時需稀釋抗體，以利于合理配比抗原抗體，形成可見凝集l 反應(yīng)效價多以抗體稀釋度來判定凝集反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn) 反應(yīng)敏感、快速，操作簡便，無需特殊儀器設(shè)備，適應(yīng)性強(qiáng)凝集反應(yīng)的用途Ø 檢測各種抗原Ø 檢測細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體Ø 用于青霉素抗體、花粉抗體等抗體的檢測小結(jié)l 凝集反應(yīng)試驗(yàn)是以顆粒性抗原或致敏載體微粒的凝集為判定結(jié)果的檢驗(yàn)方法，包括直接凝集法和間接凝集法l 直接凝集試驗(yàn)中的玻片法是一種定性試驗(yàn)，常用

39、于鑒定血型、細(xì)菌等；試管法是一種半定量試驗(yàn)，以效價判定結(jié)果。l 間接凝集試驗(yàn)中的正向凝集試驗(yàn)是用已知的抗原檢測未知抗體；反向凝集試驗(yàn)和協(xié)同凝集試驗(yàn)是用已知的抗體檢測未知的抗原；間接凝集抑制試驗(yàn)即可檢測抗原，又有檢測抗體（四）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) precipitation可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在適當(dāng)條件下，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象參與反應(yīng)的抗原稱沉淀原，抗體稱沉淀素沉淀反應(yīng)：l 液相沉淀試驗(yàn)：環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 絮狀沉淀試驗(yàn)l 凝膠沉淀試驗(yàn) 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)l 免疫電泳技術(shù) 對流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫電泳 自動化免疫電泳l 免疫濁度測定 免疫透射濁度測定 免疫膠乳濁度測定

40、 免疫散射濁度測定沉淀反應(yīng)的影響因素l 電解質(zhì)l 溫度l 抗原抗體的親和力 - 一般用多克隆抗體，容易與多個抗原表位結(jié)合 - 單克隆抗體適合結(jié)合有多個相同表位的抗原 - 免疫小動物獲得的R型抗體與抗原有較寬的合適比例范圍且親和力高l 抗體與抗原的比例，初始濃度抗體量固定的沉淀反應(yīng)曲線l 一般來講，當(dāng)抗體的濃度剛好能使所有抗原表位都結(jié)合時，抗原和抗體的濃度是最適合的l 由于沉淀反應(yīng)中使用的抗原分子很小，表位比較多，因此更容易出現(xiàn)抗原過剩的情況，所以常需要對抗原進(jìn)行稀釋使用l 合適比例確定：絮狀沉淀試驗(yàn)第一節(jié) 液相沉淀試驗(yàn)一、環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 在兩液體界面間進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)，一般在小口徑試管或毛細(xì)

41、管內(nèi)進(jìn)行。快速的定性試驗(yàn)，靈敏度低，已少用。二、絮狀沉淀試驗(yàn) 常用于抗原抗體最適比的測定：稀釋抗原法，稀釋抗體法，棋盤格法第二節(jié) 凝膠沉淀試驗(yàn)?zāi)z沉淀試驗(yàn) gel phase precipitation 抗原和抗體在含電解質(zhì)瓊脂糖凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散，形成濃度梯度，在二者比例適當(dāng)處出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。 方法簡單方便，但靈敏度較低。常用瓊脂糖凝膠濃度為1%，分子量在100 KD以上的分子不能自由擴(kuò)散：l 游離抗原、抗體可被洗脫l 抗原-抗體復(fù)合物被固定，方便后續(xù)工作凝膠網(wǎng)孔有一定限度，當(dāng)抗原抗體結(jié)合成分子量在百位以上的復(fù)合物時被網(wǎng)格在凝膠中出現(xiàn)肉眼可見沉淀物。分子越大，擴(kuò)散越慢，以判斷分子量

42、；濃度越大，擴(kuò)散越快，以判斷濃度。 凝膠沉淀試驗(yàn)步驟舉例 材料：瓊脂粉、平皿、打孔器、生理鹽水或其他緩沖溶液、抗原抗體一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) single immunodiffusion test 在融化的瓊脂中混入抗體，冷凝后將待測抗原溶液向凝膠內(nèi)擴(kuò)散，形成沉淀環(huán)l 應(yīng)用： 經(jīng)典抗原定量技術(shù)?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣本中的抗原濃度，或測定樣本中的抗體濃度（逆向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)）。l 特點(diǎn)： 重復(fù)性和線性好，但靈敏度稍差抗原濃度 （x軸） 沉淀環(huán)直徑（y軸）Mancini曲線：C=kd2Fahey曲線： logC=kd 二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)double immunodiffusi

43、on test 抗原與抗體各自在凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散，在二者比例適當(dāng)處形成沉淀線l 沉淀線的數(shù)目、位置和形態(tài)與抗原和抗體的純度、濃度、相對分子量、擴(kuò)散速度等有關(guān)l 通過沉淀線的情況可分析：1、抗原、抗體的定性分析2、抗原、抗體相對分子量和濃度ü 沉淀線向分子量大的方向彎曲 沉淀線靠近濃度較低的一方ü 濃度決定位置，分子量決定形狀3、抗原、抗體的純度鑒定 抗原-抗體單一對應(yīng)，產(chǎn)生一條沉淀線 抗原-抗體多種成分對應(yīng)，產(chǎn)生多條沉淀線4、抗體效價測定選出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算效價 5、抗原性質(zhì)分析第三節(jié) 免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù) Immunoelectrophoresis (IEP)

44、凝膠擴(kuò)散試驗(yàn) + 直流電場優(yōu)點(diǎn)：- 提高沉淀反應(yīng)的速度和敏感度 - 根據(jù)蛋白所帶電荷不同進(jìn)行分離，可進(jìn) 行細(xì)致的成分分析一、免疫電泳：先電泳，后雙向免疫擴(kuò)散 常用此法進(jìn)行血清蛋白種類的分析，對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。二、對流免疫電泳 CIEP counter immunoelectrophresis 雙向瓊脂擴(kuò)散+電泳：同時進(jìn)行pH8.2-8.6Ag泳向正極Ab泳向負(fù)極應(yīng)用：- 靈敏度高，但分辨率低于雙向瓊脂擴(kuò)散 - 抗原不能是Ig蛋白（Ab、Ag會同向泳動）三、火箭免疫電泳 RIEP rocket immunoelectrophresis 單向瓊脂擴(kuò)散+電泳：

45、同時進(jìn)行含抗體凝膠- 抗原泳向正極- 抗原和抗體形成峰狀沉淀孔中加抗原峰高與抗原的量成正比，與同樣條件下已知濃度的Ag標(biāo)準(zhǔn)品比較可得到待測Ag的含量，反之可測Ab的含量（反向火箭免疫電泳）。第四節(jié) 免疫濁度測定免疫濁度測定 immunoturbidimentry 抗原-抗體復(fù)合物（IC）在增濁劑作用下，形成微粒，使溶液變濁。保持抗體過量，一定范圍內(nèi)濁度與抗原的量成正比（前帶）。應(yīng)用：對照標(biāo)準(zhǔn)品的濃度曲線，可對抗原樣品進(jìn)行定量。透射比濁法和散射比濁法抗原量越高IC越多透射光越少，散射光越多免疫膠乳比濁法反向間接凝集試驗(yàn)+光電比濁用抗體致敏大小適中、均勻一致的乳膠顆粒，以提高測定的靈敏度。根據(jù)測定

46、時間不同，免疫比濁分為：1、終點(diǎn)比濁法 抗原、抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時測定 評價 IC可能會聚合成較大凝聚物，使光信號減弱 耗時長、需扣除本底 2、速率比濁法 測定IC形成的散射光速率峰，峰值大小與抗原濃度成正比 評價 耗時較短，靈敏度高，不需扣除本底 對儀器性能和抗體質(zhì)量要求較高影響免疫濁度測定的因素l 抗原抗體比例：保持抗體過量l 抗體的質(zhì)量： 特異性、效價、親和力、等價帶范圍l 反應(yīng)的環(huán)境條件：緩沖液的離子強(qiáng)度、離子種類、pH值，溫度等l 入射光波長l 內(nèi)源性光漫射干擾l 偽濁度偽濁度：并非由抗原、抗體特異性結(jié)合生成的免疫復(fù)合物（IC）形成的濁度，是假陽性的重要原因1、標(biāo)本渾濁，含高血脂，保存

47、時間過長2、抗血清效價太低，或經(jīng)過滅活，存在交叉反應(yīng)3、PEG過高使血清中雜蛋白非特異性共沉淀4、試劑被污染，儀器不夠清潔5、反應(yīng)條件不合適使蛋白質(zhì)變性、鹽析免疫比濁法的使用規(guī)則l 使用新鮮樣本，離心或稀釋后再使用l 避免加熱滅活抗血清和樣本l 選用等價帶范圍寬的R型抗體，保證效價在1:20以上、且親和力和特異性均高l 保持合適的pH值和離子強(qiáng)度，一般用磷酸緩沖液，反應(yīng)pH在6.5-8.5l 保證比色皿潔凈，試劑未被污染（可濾膜過濾）l 每次更換試劑需重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線l 選擇合適的入射光波長l 設(shè)置空白試劑、抗血清和樣品 沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)l 抗原是相對分子質(zhì)量較小的可溶性蛋白和多糖類物質(zhì)，分散在

48、介質(zhì)中呈均勻的液相交替l 反應(yīng)形成的沉淀物主要由較大的抗體組成l 為避免分子質(zhì)量相對較小的抗原過量，常稀釋抗原以達(dá)到適當(dāng)抗原抗體比例，有利沉淀產(chǎn)生l 反應(yīng)結(jié)果以抗原稀釋度來判定效價凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)比較小結(jié)l 沉淀反應(yīng)中的抗原是可溶性的，反應(yīng)形成白色沉淀l 沉淀反應(yīng)可在液相及凝膠內(nèi)進(jìn)行l(wèi) 液相的經(jīng)典沉淀反應(yīng)主要用于定性；用免疫比濁法可進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、微量測定l 凝膠內(nèi)的沉淀反應(yīng)包括自由擴(kuò)散的單、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)合電場作用則為免疫電泳，通過沉淀線可判定抗原、抗體的性質(zhì)、相對分子量、純度等，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可測定抗原濃度（五）補(bǔ)體測定和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)免疫溶血反應(yīng) 免疫溶血反應(yīng)是指紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物激

49、活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解的反應(yīng)。反應(yīng)組分綿羊紅細(xì)胞 SRBC （無纖維蛋白）抗紅細(xì)胞抗體，即溶血素hemolysin 補(bǔ)體自學(xué)內(nèi)容：免疫溶血反應(yīng)各組分的制備免疫溶血反應(yīng)的應(yīng)用直接用途l 測定血清總補(bǔ)體活性l 測定單個補(bǔ)體成分的活性指示系統(tǒng)l 對溶血素效價進(jìn)行滴定l 檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)的抗原或抗體一、補(bǔ)體總活性的測定l 原理：補(bǔ)體可使溶血素致敏的SRBC溶解，在一定范圍內(nèi)，溶血程度與補(bǔ)體總活性成正相關(guān)。l試驗(yàn)要點(diǎn)1、使用新鮮SRBC配制2%懸液，并進(jìn)行吸光度校正 緩沖液對照透光度為100%，2%SRBC為40%2、溶血素的效價需預(yù)先滴定3、緩沖pH為7.2-7.4，可添加適量Ca2+和Mg2+增強(qiáng)補(bǔ)

50、體的活性4、用溶血素致敏SRBC時，需隨加隨搖，充分混合5、試管、吸管等器材應(yīng)清洗干凈，無脂應(yīng)用與評價l 補(bǔ)體系統(tǒng)主要參與一些病理反應(yīng)，因此補(bǔ)體活性測定常用于疾病的輔助診斷和療效判斷l(xiāng) CH50法簡便快速，但敏感性和重復(fù)性較差二、單個補(bǔ)體成分的測定1、免疫溶血法 測定補(bǔ)體的功能和活性2、化學(xué)免疫法 測定補(bǔ)體的濃度 單向免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫比濁法三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) CFT complement fixation testl 主要原理：抗原-抗體復(fù)合物可結(jié)合補(bǔ)體，從而用補(bǔ)體和致敏紅細(xì)胞來檢測抗原、抗體間有無特異性結(jié)合 反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原與待測抗體，或已知抗體 與待測抗原 補(bǔ)體系統(tǒng) 指示系統(tǒng)：

51、溶血素致敏的SRBC試驗(yàn)要點(diǎn)l 各成分的加入順序：反應(yīng)系統(tǒng)，作用一段時間后加入補(bǔ)體，最后加指示系統(tǒng)l 各成分的加入劑量要預(yù)先滴定，防止假性結(jié)果l 除了標(biāo)準(zhǔn)的陽性和陰性對照，還應(yīng)對試驗(yàn)用的各成分設(shè)置對照檢查l 器材潔凈無脂，試劑無菌，防止抗補(bǔ)體現(xiàn)象應(yīng)用與評價l 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)主要用于抗原、抗體的定性檢測診斷病毒性疾病和螺旋體立克次體等疾病及定量分量，也可分析抗原的結(jié)構(gòu)差異分型鑒定l 由于補(bǔ)體活化過程的放大作用，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，不需特殊儀器l 因參與反應(yīng)的成分多，操作較繁瑣，影響因素多，且補(bǔ)體難以標(biāo)準(zhǔn)化，目前該方法的應(yīng)用已逐漸減少小結(jié)l 補(bǔ)體檢測主要包括補(bǔ)體溶血活性測定、單個補(bǔ)體成分的含量或溶血活性測定l 補(bǔ)體活性測定常用CH50法l 根據(jù)補(bǔ)體能