第一節(jié)概述生化分析

1、第一節(jié)第一節(jié) 概述（概述（generalization） 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳電泳。由于不同離子。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。離。第六章第六章 電泳分離技術(shù)電泳分離技術(shù) 1937年，年，Tiselius(瑞典瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶

2、液電泳，第一次進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和液分離出白蛋白和、球球蛋白；蛋白； 第一次的自由溶液電泳；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；第一臺電泳儀； 帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度中泳動的速度稱帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度中泳動的速度稱遷移率遷移率或或泳動泳動度度(mobility)，可用下式表示：可用下式表示： =E=d/tV/L式中式中：泳動度泳動度cm2(Vs)；：顆粒泳動速度顆粒泳動速度(cms)；E：電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 (Vcm)；d：顆粒泳動的距離顆粒泳動的距離 (cm) ；t：通電時間通電時間(s或或min);V：實(shí)際電壓實(shí)際電壓(V

3、)；L：支持物的有效長度支持物的有效長度(cm)。一、泳動度（遷移率）一、泳動度（遷移率）基本原理基本原理二、影響泳動度的因素二、影響泳動度的因素1. 顆粒性質(zhì)顆粒性質(zhì) 顆粒的顆粒的直徑、形狀直徑、形狀及及所帶靜電荷量所帶靜電荷量對泳動速度對泳動速度有較大影響。一般來說顆粒帶凈電荷量越多，顆粒越小，有較大影響。一般來說顆粒帶凈電荷量越多，顆粒越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之則越慢。則越慢。2. 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度（電位梯度或電勢梯度）（電位梯度或電勢梯度） 單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降。單位長度（每一厘米）支持物

4、體上的電位降。 電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動越快。電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動越快。根據(jù)電場強(qiáng)度的不同，電泳可分為兩根據(jù)電場強(qiáng)度的不同，電泳可分為兩種。種。(1) 常壓電泳常壓電泳(100-500V)：其電場強(qiáng)度為：其電場強(qiáng)度為210 V/cm。分離時間較長，從數(shù)分離時間較長，從數(shù)小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。(2)高壓電泳高壓電泳(500-10000V)：其電場強(qiáng)度為：其電場強(qiáng)度為70200V/cm，電泳時間很短，有電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核

5、苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。需冷卻裝置。需冷卻裝置。3. 溶液的性質(zhì)溶液的性質(zhì) 主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的pH值、離子強(qiáng)度值、離子強(qiáng)度和和粘度粘度等。等。 （1）pH值：值：溶液溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，也決定了值決定帶電顆粒的解離程度，也決定了 其帶凈電荷的量。對蛋白質(zhì)、氨基酸而言，當(dāng)其帶凈電荷的量。對蛋白質(zhì)、氨基酸而言，當(dāng)pH值等于其值等于其pI時，凈電荷為時，凈電荷為0，也為也為0。溶液的。溶液的pH值離其等電點(diǎn)越值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則其帶凈電荷量就越多，從而泳動速度就越快。反之，遠(yuǎn)，則其帶凈電荷量就越多，從而泳動速度就

6、越快。反之，則越慢。因此電泳時應(yīng)選擇適宜的則越慢。因此電泳時應(yīng)選擇適宜的pH值，并需采用緩沖溶值，并需采用緩沖溶液，使溶液的液，使溶液的pH值恒定。值恒定。（2）離子強(qiáng)度：）離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度一般在溶液的離子強(qiáng)度一般在0.020.2之之間時，電泳較合適。若離子強(qiáng)度過高，則會降低顆間時，電泳較合適。若離子強(qiáng)度過高，則會降低顆粒的泳動速度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與粒的泳動速度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴(kuò)散其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴(kuò)散層。若離子強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，往往會因溶層。若離子強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液液pH值

7、變化而影響泳動的速率。在保持足夠緩沖能值變化而影響泳動的速率。在保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小。力前提下，離子強(qiáng)度要最小。 （3）溶液粘度：）溶液粘度：泳動度與溶液粘度是成反比關(guān)系。泳動度與溶液粘度是成反比關(guān)系。因此，粘度過大或過小，必然影響泳動度。因此，粘度過大或過小，必然影響泳動度。4. 電滲電滲 當(dāng)支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，常常會有一些當(dāng)支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，常常會有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。在電場作用離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。在電場作用下，此溶液層會向負(fù)極移動。反之，

8、若支持物的離下，此溶液層會向負(fù)極移動。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會向正極移子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會向正極移動。這種溶液層的泳動現(xiàn)象稱為動。這種溶液層的泳動現(xiàn)象稱為電滲電滲。 因此，當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向一致時，則因此，當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向一致時，則加快顆粒的泳動速度；當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方加快顆粒的泳動速度；當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向相反時，則降低顆粒的泳動速度。向相反時，則降低顆粒的泳動速度。5. 焦耳熱焦耳熱 在電泳過程中，電流強(qiáng)度與釋放出熱量（在電泳過程中，電流強(qiáng)度與釋放出熱量（Q）之間）之間的關(guān)系可列成如下公式：的關(guān)系可列成如下公式：

9、QI2Rt 式中式中R為電阻；為電阻；t為電泳時間；為電泳時間；I為電流強(qiáng)度。公式表明，電為電流強(qiáng)度。公式表明，電泳過程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比。當(dāng)電場強(qiáng)度泳過程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比。當(dāng)電場強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時，電流強(qiáng)度會隨著增大。這不或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時，電流強(qiáng)度會隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。持物。 6. 篩孔篩孔支持物瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠都有大小不支持物瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快。反等

10、的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快。反之，則泳動速度慢。之，則泳動速度慢。三、電泳的分類三、電泳的分類1. 顯微電泳顯微電泳 用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細(xì)胞和正常細(xì)的過程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性等方面。胞的差異性等方面。2. 自由界面電泳自由界面電泳 又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的自又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的自由溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)由溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時費(fèi)力，不能完全地分離混合物的各個組成等一些時費(fèi)力，不能完全地

11、分離混合物的各個組成等一些不可克服的缺點(diǎn)，已逐漸為區(qū)帶電泳所代替。不可克服的缺點(diǎn)，已逐漸為區(qū)帶電泳所代替。 目前電泳的類目前電泳的類型很多，最常型很多，最常見的是見的是區(qū)帶電區(qū)帶電泳泳，由于在支，由于在支持物上電泳時持物上電泳時各組分因遷移各組分因遷移速度不同被分速度不同被分離成若干區(qū)帶離成若干區(qū)帶而得名。而得名。3. 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳按支持物種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：按支持物種類的不同，區(qū)帶電泳可分為： 紙電泳：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。酸的定性定量分析。 醋酸纖維素薄膜電泳：醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析醫(yī)學(xué)上，常用于分

12、析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。便于保存照相，比紙電泳分辨率高。v以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。少進(jìn)行分離。 淀粉凝膠電泳：淀粉凝膠電泳：天然淀粉經(jīng)加工處理即可使天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，且批間質(zhì)量相差很用，但孔徑度可調(diào)性差，且批間質(zhì)量相差很大，結(jié)果重現(xiàn)性差，電泳時間長，操作麻煩，大，結(jié)果重現(xiàn)性差，電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，很少使用。分辨率低，很少使用

13、。 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。有很小的分子篩效應(yīng)。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率較高。的分離、純化及檢測。分辨率較高。 根據(jù)支持介質(zhì)性狀不同，區(qū)帶電泳可分為：根據(jù)支持介質(zhì)性狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳薄層電泳、板電泳、柱電泳。 根據(jù)用途不同，區(qū)帶電泳可分為：根據(jù)用途不同，區(qū)帶電泳可分為：分析電分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳泳、制備電泳、定量免疫電泳。紙

14、電泳是以濾紙為支持體的電泳技術(shù)。紙電泳是以濾紙為支持體的電泳技術(shù)。根據(jù)電場強(qiáng)度的不同，可分為根據(jù)電場強(qiáng)度的不同，可分為常壓紙電泳常壓紙電泳和和高壓紙電泳高壓紙電泳兩類。兩類。高壓電泳高壓電泳速度快，適用于小分子物質(zhì)，如氨速度快，適用于小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多肽、糖類等的分離；但由基酸、核苷酸、多肽、糖類等的分離；但由于其電壓高，發(fā)熱量大，需附有冷卻裝置。于其電壓高，發(fā)熱量大，需附有冷卻裝置。常壓電泳常壓電泳設(shè)備簡單，適用于大分子物質(zhì)的分設(shè)備簡單，適用于大分子物質(zhì)的分離，但電泳速度較慢，區(qū)帶易擴(kuò)散。離，但電泳速度較慢，區(qū)帶易擴(kuò)散。 紙紙 電電 泳泳一、緩沖液的選擇一、緩沖液的選擇 1.

15、首要條件：保證分離組分在此系統(tǒng)的首要條件：保證分離組分在此系統(tǒng)的溶解性能、溶解性能、 穩(wěn)定性能穩(wěn)定性能及生物活性及生物活性 2. 有較高的電泳有較高的電泳速度速度 3. 有較高的有較高的分辨率分辨率4. 對顯色劑和紫外光吸收等對顯色劑和紫外光吸收等觀察觀察電泳區(qū)帶的方法沒電泳區(qū)帶的方法沒 有影響。有影響。二、濾紙的選擇與剪裁二、濾紙的選擇與剪裁1. 一般采用層析濾紙。一般采用層析濾紙。2. 電泳分離所用的濾紙應(yīng)選用電泳分離所用的濾紙應(yīng)選用紙質(zhì)均勻和吸附力小紙質(zhì)均勻和吸附力小的。的。 3. 雙向電泳用正方形濾紙。雙向電泳用正方形濾紙。三、電泳操作要點(diǎn)三、電泳操作要點(diǎn)1點(diǎn)樣點(diǎn)樣 對于對于未知樣品未

16、知樣品，初次試驗(yàn)時應(yīng)將樣品點(diǎn)在紙，初次試驗(yàn)時應(yīng)將樣品點(diǎn)在紙中央，以觀察樣品電泳時的移動方向；中央，以觀察樣品電泳時的移動方向； 對于對于已知樣品已知樣品，原點(diǎn)位置應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選，原點(diǎn)位置應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇，但必須距離緩沖液液面擇，但必須距離緩沖液液面5 cm以上，濾紙兩端以上，濾紙兩端應(yīng)標(biāo)明電極的極性應(yīng)標(biāo)明電極的極性“+”或或“”。原點(diǎn)形狀一般呈。原點(diǎn)形狀一般呈圓形或長條形，但長條形分離效果較好。但樣品圓形或長條形，但長條形分離效果較好。但樣品量少時，則呈圓點(diǎn)，便于顯色和定性。量少時，則呈圓點(diǎn)，便于顯色和定性。 點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣方法 濕點(diǎn)法：濕點(diǎn)法：將裁好的濾紙全部浸入緩沖液中，濕潤后，將裁好的

17、濾紙全部浸入緩沖液中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，將取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液。樣品液要求較濃，不宜多次點(diǎn)樣。供試品溶液。樣品液要求較濃，不宜多次點(diǎn)樣。 干點(diǎn)法：干點(diǎn)法：將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。試品溶液。 2

18、. 電泳電泳 電泳時，電泳槽應(yīng)放平，兩個槽的液面應(yīng)保持電泳時，電泳槽應(yīng)放平，兩個槽的液面應(yīng)保持同一水平，電泳槽應(yīng)蓋上斜頂蓋子，以防緩沖液蒸同一水平，電泳槽應(yīng)蓋上斜頂蓋子，以防緩沖液蒸發(fā)并避免冷凝水滴落在電泳紙上。電泳時，應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)并避免冷凝水滴落在電泳紙上。電泳時，應(yīng)調(diào)節(jié)好電壓并使之穩(wěn)定，并要注意電泳時間。電泳結(jié)束好電壓并使之穩(wěn)定，并要注意電泳時間。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出電泳紙烘干或吹干。后，關(guān)閉電源，取出電泳紙烘干或吹干。3. 顯色顯色 不同物質(zhì)采用不同的顯色方法。核酸類物質(zhì)可在紫不同物質(zhì)采用不同的顯色方法。核酸類物質(zhì)可在紫外光下觀察，但大多數(shù)物質(zhì)需用顯色劑顯色。外光下觀察，但大多數(shù)物質(zhì)需

19、用顯色劑顯色。(1)蛋白質(zhì)的顯色蛋白質(zhì)的顯色 溴酚藍(lán)顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)色溴酚藍(lán)顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)色 氨黑氨黑10B顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)黑色顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)黑色 偶氮胭脂紅偶氮胭脂紅B顯色法：蛋白質(zhì)處呈櫻紅色顯色法：蛋白質(zhì)處呈櫻紅色(2) 氨基酸顯色法氨基酸顯色法 茚三酮顯色法：一般為紫色茚三酮顯色法：一般為紫色 靛紅靛紅(吲哚醌吲哚醌)顯色法：各種氨基酸呈不同顏色顯色法：各種氨基酸呈不同顏色醋酸纖維素薄膜電泳的優(yōu)點(diǎn)醋酸纖維素薄膜電泳的優(yōu)點(diǎn) 分離效果好。分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無“拖尾拖尾”現(xiàn)象，現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色。染色后背景能完全脫色。 快速省

20、時?？焖偈r。由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時大由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快。部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快。 靈敏度高，樣品用量少。靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需血清蛋白電泳僅需2 L血清血清 應(yīng)用面廣。應(yīng)用面廣。某些蛋白質(zhì)在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種某些蛋白質(zhì)在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。能較好地分離。 易保存，易定量。易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸、醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰

21、乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于掃乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于掃描定量及長期保存。描定量及長期保存。 薄層電泳是將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)薄層電泳是將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層而進(jìn)行電泳的技術(shù)。厚度的薄層而進(jìn)行電泳的技術(shù)。 常用的支持物有常用的支持物有淀粉、瓊脂、纖維素粉、淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠硅膠等。其中以淀粉最為常用。由于淀粉易等。其中以淀粉最為常用。由于淀粉易成型，對蛋白質(zhì)吸附少，樣品易洗脫，電滲成型，對蛋白質(zhì)吸附少，樣品易洗脫，電滲作用低，分離效果好，所以淀粉板薄層電泳作用低，分離效果好，所以淀粉板薄層電泳廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、

22、酶和核酸的分離。廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、酶和核酸的分離。 淀粉板薄層電泳淀粉板薄層電泳1緩沖液的選擇緩沖液的選擇 淀粉板薄層電泳所用緩沖液可用紙電泳的緩沖淀粉板薄層電泳所用緩沖液可用紙電泳的緩沖液。但由于淀粉顆粒有離子交換作用，因此必須液。但由于淀粉顆粒有離子交換作用，因此必須采用離子強(qiáng)度較高的緩沖液采用離子強(qiáng)度較高的緩沖液(0.05-0.1molL) 2支持物的處理支持物的處理 薄層電泳所用的支持物需用精制品。薄層電泳所用的支持物需用精制品。3薄層板的制作薄層板的制作 在玻璃板上鋪上蠟紙，放上尺寸適宜的框架；在玻璃板上鋪上蠟紙，放上尺寸適宜的框架；將精制淀粉與緩沖液混勻后倒進(jìn)框架中，靜置十余將

23、精制淀粉與緩沖液混勻后倒進(jìn)框架中，靜置十余小時。待淀粉沉降后，除去上清液。至淀粉表面稍小時。待淀粉沉降后，除去上清液。至淀粉表面稍干，取去框架即成淀粉薄層板。干，取去框架即成淀粉薄層板。4加樣加樣 在淀粉板中間，用小刀挖出淀粉成一條約寬在淀粉板中間，用小刀挖出淀粉成一條約寬5mm大小的溝，將樣品與挖出之淀粉混勻后，重新大小的溝，將樣品與挖出之淀粉混勻后，重新填入原處壓平。淀粉板兩端用幾層紗布與兩極的緩填入原處壓平。淀粉板兩端用幾層紗布與兩極的緩沖液連接，通上電流，電泳一定的時間。沖液連接，通上電流，電泳一定的時間。 5電泳斑紋的觀察電泳斑紋的觀察 可用印染法觀察電泳斑紋位置：即在電可用印染法觀

24、察電泳斑紋位置：即在電泳結(jié)束后，取一張與薄層板大小相同的濾紙泳結(jié)束后，取一張與薄層板大小相同的濾紙，用緩沖液浸濕后平放于薄層板上，輕輕壓，用緩沖液浸濕后平放于薄層板上，輕輕壓平。平。23min后，取下濾紙吹干顯色，即可后，取下濾紙吹干顯色，即可觀察到斑紋位置；按印染法所確定的位置，觀察到斑紋位置；按印染法所確定的位置，將薄層板分段切開，可將各組分分別洗脫下將薄層板分段切開，可將各組分分別洗脫下來。來。一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn) 天然瓊脂天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要是一種多聚糖，主要由瓊脂糖由瓊脂糖(agarose，約占約占80)及瓊脂果及瓊脂果膠膠(agaropecti

25、n)組成。組成。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單，電泳速度快，樣品不須事先處理就可操作簡單，電泳速度快，樣品不須事先處理就可進(jìn)行電泳。進(jìn)行電泳。 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占約占9899)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。重復(fù)性好。 瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。 電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定電泳后區(qū)帶易染色，樣

26、品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。制成干膜可長期保存。二、二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的據(jù)它們的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。凝膠的濃度也有密切關(guān)系。1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系 (1) DNA分子的大小分子的大小 在凝膠中，在凝膠中，DNA片段遷移距離片段遷移距離(遷移率遷移率)與與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進(jìn)行比

27、準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進(jìn)行比較，便可測出未知片段的大小。較，便可測出未知片段的大小。應(yīng)用凝膠電泳可以正確的測定應(yīng)用凝膠電泳可以正確的測定DNA片段的分子大小。使用的方法是在同片段的分子大小。使用的方法是在同一膠上加一已知其相對分子質(zhì)量的樣一膠上加一已知其相對分子質(zhì)量的樣品。電泳完畢后，經(jīng)溴化乙錠染色，品。電泳完畢后，經(jīng)溴化乙錠染色，照相，從照片上比較待測樣品中的照相，從照片上比較待測樣品中的DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)品中的哪一條帶最片段與標(biāo)準(zhǔn)品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。目前許多試劑公司都能提供的大小。目前許多試劑公司都能提供各種不同

28、相對分子質(zhì)量比的標(biāo)準(zhǔn)樣品。各種不同相對分子質(zhì)量比的標(biāo)準(zhǔn)樣品。 通常以通常以相對遷移率相對遷移率mR來表示遷移率，相對遷移來表示遷移率，相對遷移率的計(jì)算方法如下：率的計(jì)算方法如下：相對遷移率相對遷移率mR=樣品遷移距離（樣品遷移距離（cm）染料遷移距離（染料遷移距離（cm）(2) 瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線狀線狀DNA大小大小/kb605201 100.8 70.5 60.4 40.2 30.1瓊脂糖濃度與瓊脂糖濃度與DNA分離范圍分離范圍2核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型不同構(gòu)型DN

29、A的移動速度次序?yàn)椋旱囊苿铀俣却涡驗(yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)超螺旋共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA 直線直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA (2) 緩沖液系統(tǒng)緩沖液系統(tǒng) 常用的電泳緩沖液有常用的電泳緩沖液有EDTA (pH8.0)和和Tris-乙酸乙酸(TAE)，Tris-硼酸硼酸 (TBE)或或Tris-磷磷酸酸 (TPE)等，濃度約為等，濃度約為50mmolL(pH7.57.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。臨用時稀釋到所需倍數(shù)。3電泳方法電泳方法 (1) 凝膠類型凝膠類型 用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型垂直型及及水平型水平型(平板型平板型)。(4) 樣品配制與加樣樣品配制與加樣 DNA樣品用適量的樣品用適量的Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有內(nèi)含有0.2