細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)

1、細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)課程論文題 目: 逆境脅迫下植物細(xì)胞的生理變化的測(cè)定 姓 名: 尹新強(qiáng) 學(xué) 院: 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè): 植物學(xué) 班 級(jí): 一班 學(xué) 號(hào): 2014116001 導(dǎo) 師: 蔡慶生 2014 年 12 月 8 日逆境脅迫下植物細(xì)胞的生理變化的測(cè)定摘要：植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中往往會(huì)受到不良因素的影響，包括各種生物脅迫以及非生物脅迫，植物自身為了生存必須抵抗這些不良條件，或是適應(yīng)這種條件。由于植物種屬的差異性，不同植物的抗性不同，為此研究植物的逆境脅迫，對(duì)于種質(zhì)資源的選擇，不良環(huán)境的生態(tài)修復(fù)都具有重要意義，為此本文主要根據(jù)自己所在實(shí)驗(yàn)室的研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)單介紹在各種非生物脅迫下，植物的滲透

2、勢(shì)、細(xì)胞膜損傷、活性氧的生理變化。關(guān)鍵字：逆境 脅迫 滲透勢(shì) 膜損傷 活性氧 一、逆境脅迫下植物細(xì)胞的生理變化 一般植物要完成從種子然的萌發(fā)、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、開花、結(jié)果等生長(zhǎng)發(fā)育過程，需要充足的水分、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，適宜的光照、溫度和足夠的氧氣等環(huán)境條件。然而在自然條件下，各地所處的地理位置、氣候條件、病蟲害及由于工農(nóng)業(yè)發(fā)展所帶來的環(huán)境污染等情況的差異，即使同一地區(qū)，一年也有冷熱旱澇之分。植物常常生活在多變的環(huán)境中，同動(dòng)物相比，植物的空間位移比較差。植物在生活的環(huán)境中常常遭受到不良環(huán)境的襲擊。因此植物在生長(zhǎng)過程中幾乎不可避免要受到不良環(huán)境的影響，譬如干旱、高鹽、高溫、低溫、冷凍、病蟲害、重金屬、輻射、大

3、氣污染有時(shí)這種影響是嚴(yán)重的甚至是致命的。因植物種類不同，植物會(huì)有不同的表現(xiàn)，有的能夠生存，有的則受害致死。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在我國(guó)具有十分重要的地位，為此研究植物在逆境脅迫下的生命活動(dòng)規(guī)律，特別是逆境脅迫下抵御不良環(huán)境的生理分子機(jī)制，就顯得十分重要。逆境脅迫脅迫下植物生理代謝會(huì)發(fā)生變化，眾多研究表明植物在干旱、高鹽、低溫等脅迫下，都會(huì)產(chǎn)生水分虧缺現(xiàn)象。植物吸水減少，蒸騰不足，但是蒸騰大于吸水，組織含水量減少，造成植物萎焉。植物細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜等膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，滲透性加大，胞內(nèi)物質(zhì)明顯外滲，電解質(zhì)滲漏率加大，所以通常用滲漏率衡量植物抗逆性的強(qiáng)弱。逆境下植物的光合作用減弱，可能由于逆境條件下葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破

4、、光合酶失活、氣孔關(guān)閉增大氣體擴(kuò)散阻力引起的。植物呼吸速率發(fā)生改變，逆境下植物體內(nèi)磷酸化酶、蛋白酶活性升高，淀粉水解，蛋白質(zhì)水解加強(qiáng)，可溶性糖含量升高，逆境蛋白表達(dá)升高，脫落酸含量增加1。研究植物逆境脅迫下生理變化往往可從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，膜損傷，活性氧三個(gè)方面進(jìn)行分析。首先滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境脅迫下植物通過積累各種有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)提高細(xì)胞液的濃度，降低滲透勢(shì)，提高細(xì)胞吸水或保水能力。值得注意的是無機(jī)離子調(diào)節(jié)經(jīng)濟(jì)但積累過多會(huì)產(chǎn)生毒性，有機(jī)物質(zhì)調(diào)節(jié)雖然無直接毒害，但消耗大量光合產(chǎn)物。通過測(cè)定相同植物或不同植物在脅迫組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，無機(jī)離子有k、Na、Cl等，有機(jī)物質(zhì)脯氨酸、甜菜堿、可

5、溶性糖（葡萄糖、蔗糖）2。然后膜損傷方面，正常情況下植物細(xì)胞膜有選擇通過功能，細(xì)胞的物質(zhì)交換、信號(hào)傳導(dǎo)都由膜結(jié)構(gòu)完成。脅迫下膜結(jié)構(gòu)首先會(huì)遭受損傷，如果膜結(jié)構(gòu)破壞會(huì)導(dǎo)致選擇透過性功能喪失，電解質(zhì)外滲，因此可以通過測(cè)量細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率（無機(jī)離子），紫外吸收值（有機(jī)物質(zhì)）。最后可從活性氧角度測(cè)定脅迫傷害程度，正常植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡，植物體內(nèi)清除活性活性氧的系統(tǒng)有兩種，一種酶系統(tǒng)，一種非酶系統(tǒng)，前者主要通過抗氧化物質(zhì)起作用，譬如，GSH、維生素C、類胡蘿卜素。后者通過SOD、CAT、POD、APX等發(fā)揮酶促清除作用。植物受到環(huán)境脅迫，一旦這種平衡被打破，活性氧積累加劇，清除不足，

6、造成膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生丙二醛（MDA），丙二醛釋放后結(jié)合蛋白質(zhì)和核酸，改變分子構(gòu)型，使分子交聯(lián)，功能喪失，作用的結(jié)果導(dǎo)致膜系統(tǒng)會(huì)破壞，造成生理紊亂。因此通過測(cè)定各種抗氧化物質(zhì)和各種酶活性及丙二醛的含量可以反映植物脅迫下的生理變化，作為植物抗逆性的指標(biāo)1。二、脅迫下植物細(xì)胞常見的生理指標(biāo)的測(cè)定以下實(shí)驗(yàn)過程僅作參考，用于輔助說明，不具代表性，具體實(shí)驗(yàn)以個(gè)人實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為準(zhǔn)。以高溫、低溫脅迫為例簡(jiǎn)單說明細(xì)胞膜損傷后離子濃度的測(cè)定方法3-6，首先培育幼苗，選取生長(zhǎng)一致、苗齡適當(dāng)?shù)挠酌?，分成葉片、根、莖和芽4部分，選取上部剛展開的葉、全部根系、中部莖和頂端兩片嫩芽。然后將葉片剪成12小片，莖剪成0.5小段，用

7、去離子水洗凈，紗布擦干，每部位稱取約0.1，裝入密封袋內(nèi)，分別進(jìn)行溫度梯度處理，譬如，低溫溫度梯度可設(shè)為為4、0、-2、-4、-6、-8和-10 ，（可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)材料合理設(shè)置）在低溫冷凍槽內(nèi)進(jìn)行，采用連續(xù)降溫的方法，每個(gè)溫度梯度處理1，取出室溫靜置解凍2后，測(cè)定電導(dǎo)值(0)。高溫處理的溫度梯度可設(shè)為：25、30、35、40、45、50、55和60 ，處理時(shí)間為15，測(cè)定電導(dǎo)值。最后以室溫下植物葉片的電導(dǎo)值為對(duì)照()，以相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞傷害率，計(jì)算公式：相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(-)/(0-)×100%。以紫外輻射脅迫為例簡(jiǎn)單說明細(xì)胞膜損傷后各物質(zhì)的生理指標(biāo)7。采用漂浮育苗方式育烤煙苗，

8、取苗齡35d的煙苗移栽至裝有基質(zhì)的塑料盆內(nèi)，待還苗后將煙株轉(zhuǎn)移到裝有紫外線燈管(波峰值在295nm)的架子上進(jìn)行試驗(yàn)處理，燈管離煙苗頂部30一50cm。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)UVB輻射梯度，外源增加UV一B的強(qiáng)度分別為18.71士2.13 µW·-2(UV一B1)、24.00士4.06 µW·-2(UV一B2)，無外源UV一B處理時(shí)紫外線強(qiáng)度為5.55士0.84 µW·-2（CK），外源增加UV一B處理的時(shí)間為每天6h(10:00一16:00)，處理7d為1個(gè)試驗(yàn)周期，重復(fù)3次。UV一B輻射量用紫外線輻射計(jì)測(cè)定，處理期間定量澆灌Hoagland營(yíng)

9、養(yǎng)液維持煙苗正常生長(zhǎng)。以UV一B輻射處理7d后幼苗的新鮮葉片(取完全展開葉片)測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)：生物量和含水量、根冠比、葉綠素和總類胡蘿卜素含量、丙二醛含量（MDA）、脯氨酸含量，紫外線吸收物質(zhì)類黃酮的含量，可溶性總糖含量。植株高度、地上部生物量和含水量測(cè)定： 隨機(jī)取各處理幼苗30 株，剪掉根部，立即稱地上部鮮重，并測(cè)量其高度。之后將地上部于4050的烘箱內(nèi)烘至恒重， 以干重表示生物量并計(jì)算含水量。將地上、地下部分分離，于105殺青15min，65恒溫烘干至恒重，并用萬分之一電子天平稱重，計(jì)算根冠比8。葉綠素和總類胡蘿卜素含量測(cè)定：根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定

10、波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比。A=CL , 比例常數(shù)，各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A 并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。例如取新鮮葉片或其它組織或干材料，擦凈組織表面污物剪碎去掉中脈混勻。將取好的

11、樣品放入25ml容量瓶中加混合浸提液無水乙醇：丙酮=5:5 20ml放在黑暗條件下，浸泡至葉片發(fā)白，用浸提試劑定容至25ml搖勻備用。把葉綠體色素提取液倒入1cm光徑的比色皿內(nèi)，以浸提試劑為空白測(cè)定吸光度。選擇波長(zhǎng)663 646 和470nm，測(cè)定OD值，計(jì)算對(duì)應(yīng)色素含量8。光合強(qiáng)度、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度測(cè)定：用便攜式TPS-1 型光合測(cè)定儀隨機(jī)測(cè)定各處理幼苗第一片真葉的光合強(qiáng)度、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度( 各指標(biāo)測(cè)定均為煙葉第一片真葉) 。每次測(cè)定5 株幼苗, 測(cè)定于每日13: 0014: 00時(shí)進(jìn)行, 測(cè)定光強(qiáng)為1 000 1 100 Lmol·m- 2·s- 1。MDA含量測(cè)

12、定：采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，在酸性和高溫條件下，MAD可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川(3，5，5三甲基惡唑-2，4二酮)，其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。首先稱組織鮮樣0.5g，加入4ml pH7.8磷酸緩沖液冰浴研磨至勻槳，再用4ml緩沖液沖洗，用四層紗布過濾至小燒杯中，并轉(zhuǎn)移到離心管，4下10000xg，取上清液即為酶液。然后取1.5ml酶液，加入2.5ml TBA一CTA液，在沸水浴上加熱10min，迅速冷卻，以1800xg離心10min，取上清液于532nm和600nm下比色，測(cè)定OD值8。脯氨酸含量測(cè)定：原理為用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液

13、中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長(zhǎng)下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。例如準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml 3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min

14、。用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520nm波長(zhǎng)處比色，求得OD值8。黃酮含量測(cè)定：采用亞硝酸鈉，硝酸鋁氫氧化鈉比色法。該方法是目前應(yīng)用最廣泛的總黃酮含量測(cè)定方法，該法的原理是在待測(cè)物的水溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁氫氧化鈉試液、鋁離子與黃酮類化合物3，4二羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色來進(jìn)行測(cè)定。例如蘆丁化合物B環(huán)上有鄰二酚羥基與鋁離子絡(luò)合在500nm處有最大吸收，如果供試品顯色后在同一地方有最大吸收即可以蘆丁做對(duì)照品，用比色法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.60.8g樣品粉末，加入60ml 60%乙醇于100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)，置于水浴鍋上，70條件下回流提取60min。

15、過濾、定容于100ml，吸取樣品量（根據(jù)樣品的吸光度調(diào)整）1.0ml，放入10毫升容量瓶?jī)?nèi)（寫明標(biāo)記），用60%乙醇加到2.0ml；加入5%亞硝酸鈉溶液0.5ml搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁，溶液0.5ml，放置6min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0ml，搖勻后，加60%乙醇定容，放置15min；在510nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量?？傸S酮含量=A/M·100×稀釋倍數(shù) A為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的含量6?？扇苄钥偺堑臏y(cè)定：采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再與蒽酮作用形成綠色絡(luò)合物，顏色的深淺與糖含量有關(guān)。在625 nm

16、波長(zhǎng)下的OD值與糖含量成正比。由于蒽酮試劑與糖反應(yīng)的呈色強(qiáng)度隨時(shí)間變化，故必須在反應(yīng)后立即在同一時(shí)間內(nèi)比色。將植物葉片在110烘箱烘15 min，然后調(diào)至70過夜。干葉片磨碎后稱取50 mg樣品倒入10 ml刻度離心管內(nèi)加入4 ml 80%乙醇，置于80水浴中不斷攪拌40 min，離心，收集上清液，其殘?jiān)? ml 80%乙醇重復(fù)提2次，合并上清液。在上清液中加10 mg活性炭，80脫色30 min，80%乙醇定容至10 ml，過濾后取濾液測(cè)定。 吸取上述糖提取液1ml，放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然后于分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)為625nm，

17、測(cè)得吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濾液中得糖含量，然后再計(jì)算樣品中含糖百分?jǐn)?shù)。（需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）以重金屬鎘脅迫為例從活性氧角度測(cè)定脅迫傷害程度9-10。精選番茄種子500粒，用紗布將種子包起來，清水浸種34h，放入0.5%高錳酸鉀浸種2040min，取出后用清水沖洗干凈。保濕于28光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽24h，25發(fā)芽3一5d，發(fā)芽后22砂床育苗。播種后14d選長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗移至溫室內(nèi)不含鎘的營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)14d。然后進(jìn)行鎘處理：設(shè)0(CK)，0.1，1.0，5.0，10.0 µmo1L-1處理，鎘以CdCl2形式供給。鎘處理后，第7d、14d、21d、33d取樣提取酶液，以測(cè)定根、葉片中SOD、

18、POD、CAT酶活性。酶液提取參照MDA中酶液提取方法。SOD活性測(cè)定：由于超氧自由基為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測(cè)定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來測(cè)定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2·-，當(dāng)加入NBT(氧化硝基四氮哇蘭)后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長(zhǎng)下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色物質(zhì)生成速度減慢。例如吸取3ml NBT反應(yīng)液于小燒杯中，加入50µl酶液，于40001ux光照15min，以50µl NBT代

19、替50µl酶液為CK，OD560下比色。通過在反應(yīng)液中加入SOD酶液，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比，依據(jù)繪制的二者相關(guān)曲線，根據(jù)SOD抑制NBT光還原相對(duì)百分率計(jì)算酶活性7。POD活性測(cè)定：在H2O2存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物的含量來測(cè)定活性。吸取酶液50ul于10ml試管中，加入3ml蒸餾水，lml 0.3%愈創(chuàng)木酚，lml 2%H2O2(計(jì)時(shí))，5 min(25恒溫下)后比色OD470，以水調(diào)零，以不加酶液測(cè)為CK，計(jì)算活性。CAT活性測(cè)定：紫外吸收法  H 2 O 2

20、在 240nm 波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度 A 240 隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性。首先取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3ml 30%的H2O2（原液）搖勻制成反應(yīng)液。取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定OD240（測(cè)定40s），計(jì)算酶活性。近年來，隨著人類活動(dòng)頻繁，工業(yè)“三廢”排放量日益增加，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥、農(nóng)藥等大量施用，全球土壤污染愈來愈嚴(yán)重，已成為危害人類的重大因素，近年來很多學(xué)者都從事污染地生態(tài)修復(fù)，重金屬污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)及污染地能源植物資源開發(fā)技術(shù)日益興起，我們實(shí)驗(yàn)室主要研究逆境脅迫下不同植物生理耐受，研究了高鹽、低溫、干旱、紫外輻射下的耐受植物，同時(shí)利用植物針對(duì)重金屬土地污染進(jìn)行修復(fù)，符合當(dāng)前發(fā)展潮流，環(huán)保、潔凈、應(yīng)用前