生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)安全與實(shí)驗(yàn)基本操作實(shí)驗(yàn)室常用試劑的使用安全二甲苯 無色液體，有芳香氣味，易揮發(fā)。用來制造、染料、塑料和藥物。屬低毒類，對(duì)皮膚和黏膜有刺激作用，高濃度有麻醉作用。神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)受損害，還會(huì)使腎和肝受時(shí)性損傷。 眼睛接觸：蒸氣會(huì)刺激眼睛，液體導(dǎo)致嚴(yán)重刺激，發(fā)紅腫脹和灼傷。通常影響是暫時(shí)性的。皮膚接觸：產(chǎn)生灼傷感、干燥?？梢杂梦氐木徛魉疀_洗至少20分鐘，用無摩擦性的肥皂有助于從皮膚上洗去二甲苯。 易燃，有爆炸危險(xiǎn)。屬于甲類防火危險(xiǎn)物質(zhì)。用二氧化碳或干粉或泡沫滅火劑，不宜用水。三氯甲烷 無色透明易揮發(fā)液體，有特殊的香甜氣味。沸點(diǎn)：61.2，醫(yī)藥上用作麻醉劑。也用作萃取劑

2、和溶劑。 有很強(qiáng)的麻醉作用，在光的作用下，能被空氣中的氧反應(yīng)生成氯化氫和劇毒的光氣。通常加入12%乙醇，使生成的光氣與乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。 吸入高濃度蒸汽時(shí)，開始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，發(fā)生流淚、感覺麻醉、嘔吐、痙攣、直到昏睡、不省人事。 在空氣、水分和光的作用下，酸度增加，因而對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性乙醚 透明、無色、易揮發(fā)有芳香刺激性氣味的液體。沸點(diǎn)：34.6；對(duì)人體有麻醉性能。當(dāng)吸入含量為3.5%時(shí)，3040分鐘就可失去知覺。 人體過量吸入，會(huì)引起嚴(yán)重的急性中毒。呼氣中帶醚味，并出現(xiàn)嘔吐、出汗、噴嚏、咳嗽、頭痛、記憶力減退、無力、興奮。 微溶于水，易溶于鹽酸，能與醇、醚、石

3、油醚、苯、氯仿等有機(jī)溶劑混溶。應(yīng)儲(chǔ)存于陰涼、干燥、通風(fēng)的低溫庫房?jī)?nèi)，庫溫最好控制在25以下。遠(yuǎn)離熱源、火種，避免陽光直射。 本品易燃。與強(qiáng)氧化劑反應(yīng)能起火爆炸。在空氣中與氧長(zhǎng)期接觸或受光照會(huì)生成不穩(wěn)定的過氧化物，受熱能自行著火爆炸。著火時(shí)，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土滅火。用水滅火無效，但可用水保持火場(chǎng)容器冷卻。乙醇 無色有酒味，易揮發(fā)的澄清液體。沸點(diǎn)78.5：用于溶劑、清洗劑、分析試劑等。屬微毒類，對(duì)眼睛黏膜有輕微刺激作用。 乙醇可使皮膚發(fā)干，長(zhǎng)期受大劑量作用時(shí)，可使神經(jīng)系統(tǒng)、消化器官等發(fā)生嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病。 易燃，手熱或遇明火有燃燒爆炸危險(xiǎn)，燃燒時(shí)，發(fā)出蘭色火焰。蒸氣能與空氣形成爆炸性混

4、合物，在火場(chǎng)中，受熱的容器有爆炸的危險(xiǎn)。著火時(shí)，用二氧化碳、霧狀水、干粉、1211或抗泡沫滅火。用水冷卻火場(chǎng)中的容器，驅(qū)散蒸氣，趕出溢出液體，使其稀釋成為不燃性混合物冰醋酸 有酸性氣味的無色透明液體，沸點(diǎn)：118.1。用于制造氯乙烯塑料、醋酐、有機(jī)醋酸酯、醋酸鹽（鉛、鋁、銅等）及醋酸纖維；也可用于染料、制藥、罐頭食品、食品防腐、色素生產(chǎn)等工業(yè)。 屬低毒類，可經(jīng)消化道、呼吸道、皮膚吸收，對(duì)眼、皮膚和上呼吸道有刺激作用。眼睛接觸：引起眼瞼水腫、結(jié)膜充血；皮膚接觸：輕者出現(xiàn)紅斑，重者出現(xiàn)化學(xué)灼傷，有水泡和疼痛。 吸入：當(dāng)空氣中蒸氣濃度不明時(shí)，應(yīng)佩帶有黃色色標(biāo)濾毒盒（罐）的防毒面具。使用時(shí)應(yīng)有良好的通

5、風(fēng)條件和有效的防護(hù)用品，如有醋酸的泄露或?yàn)R污，應(yīng)以堿液中和，然后用水沖洗，經(jīng)稀釋的污水排入廢水系統(tǒng)。注 意 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢氣、廢液、廢渣大多數(shù)是有害的，必須經(jīng)過處理才能排放。少量有毒氣體可以通過排風(fēng)設(shè)備排出室外，被空氣稀釋。毒氣量大時(shí)，必須處理后再排出。如氧化氮、二氧化硫等酸性氣體用堿液吸收?？扇夹杂袡C(jī)廢液可于燃燒爐中通氧氣完全燃燒。 大家在實(shí)驗(yàn)室里，接觸到的化學(xué)試劑多半都有危害性，所以每個(gè)人都應(yīng)該注意保護(hù)自己，注意規(guī)范操作，同時(shí)對(duì)別人也是一種保護(hù)，而不能因?yàn)閳D省事或者別的什么原因而放松對(duì)安全的注意。實(shí)驗(yàn)誤差絕對(duì)誤差（absolute error）： 絕對(duì)誤差是測(cè)量值與真實(shí)值之差。 = x

6、 (：絕對(duì)誤差；x：測(cè)量值；：真實(shí)值） 絕對(duì)誤差是以測(cè)量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負(fù)值。測(cè)量值越接近真實(shí)值，絕對(duì)誤差越小。 真實(shí)值是一個(gè)可以接近而不可達(dá)到的理論值。上式可以寫成： = x- 說明在已知絕對(duì)誤差值的情況下，真實(shí)值可以從測(cè)定值減去絕對(duì)誤差而求得。相對(duì)誤差（relative error）： 為了反映誤差在測(cè)量結(jié)果中所占的比例，分析工作中經(jīng)常使用相對(duì)誤差。相對(duì)誤差是以真實(shí)值的大小為基礎(chǔ)表示的誤差值，沒有單位。 /=(x-)/ 通常以%， 或 ppm表示。 例如：測(cè)定純NaCl中Cl的百分含量為60.52%，而其真實(shí)含量（理論值）為60.66%。則絕對(duì)誤差=60.52%60.6

7、6% = -0.14% 相對(duì)誤差=（60.52% 60.66%） / 60.66% ×1000 = -2.3 如果不知道真實(shí)值，而知道絕對(duì)誤差值，則相對(duì)誤差也可以表示為： 相對(duì)誤差 = × 100% x 例如：用分析天平稱兩個(gè)重量，一個(gè)是0.0021g，另一個(gè)是0.5432g，兩個(gè)重量的絕對(duì)誤差都是0.0001g，可是相對(duì)誤差卻大不相同，一個(gè)是（1/21 ）×100%，另一個(gè)是（1/5432 ）×100%。 可見，由于兩個(gè)被測(cè)組分含量高低不同，即使絕對(duì)誤差相同，相對(duì)誤差也不同。對(duì)高含量組分測(cè)定的相對(duì)誤差應(yīng)當(dāng)要求小些，低含量組分測(cè)定的相對(duì)誤差要求允許大些。

8、 例如：用重量法和滴定法測(cè)量樣品主要成分，相對(duì)誤差需要達(dá)到千分之一，而用比色法測(cè)定樣品重微量成分時(shí)，相對(duì)誤差只要求達(dá)到百分之幾即可2. 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差（systematic error）也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向（正或負(fù)）和大小，重復(fù)測(cè)定時(shí)重復(fù)出現(xiàn)。根據(jù)系統(tǒng)誤差的來源，可分為： （1） 方法誤差 方法誤差是由于不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或所選方法不恰當(dāng)所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過大或有共沉淀等，都會(huì)產(chǎn)生誤差。 （2） 儀器或試劑誤差 是由于儀器未經(jīng)校準(zhǔn)或試劑不合規(guī)格引起的。例 如：天平砝碼不準(zhǔn)、容量?jī)x器刻度

9、不準(zhǔn)或試劑不純等，均能產(chǎn)生這種誤差。3） 操作誤差 操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者對(duì)滴定終點(diǎn)顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會(huì)產(chǎn)生誤差。 由于系統(tǒng)誤差是重復(fù)的以固定方向和大小出現(xiàn)，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測(cè)定次數(shù)的方法消除。3.隨機(jī)誤差（accidental error ): 也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測(cè)量條件、實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等變動(dòng)而未能得到控制的條件波動(dòng)引起的，其大小和正負(fù)都不固定。 偶然誤差的出現(xiàn)看起來似乎沒有規(guī)律，但多次測(cè)量就會(huì)發(fā)現(xiàn)絕對(duì)值相同的正負(fù)偶然誤差出現(xiàn)的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過增加平行

10、測(cè)定次數(shù)，就可以減免測(cè)定結(jié)果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估計(jì)出偶然誤差值，并在測(cè)定結(jié)果中予以正確表達(dá)。 系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點(diǎn)的顏色變化時(shí)，有人總是偏深，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。但多次測(cè)定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。5.提高分析準(zhǔn)確度的方法（1）選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?不同方法的準(zhǔn)確度和靈敏度不同。重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對(duì)常量組分的測(cè)定可以獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果，一般相對(duì)誤差不超過千分之幾。但對(duì)于微量和痕量組分的分析，常常做不出來，談不上精確度。 儀器分析法對(duì)測(cè)定常量組分無法準(zhǔn)確，但對(duì)測(cè)定微量和痕量組分靈敏度很高，盡管相對(duì)誤差較大，但絕對(duì)誤差不大，能符

11、合準(zhǔn)確度的要求。 總之，必須根據(jù)分析對(duì)象，樣品情況以及對(duì)分析結(jié)果的要求，選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?。?）減小測(cè)量誤差 為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，必須盡量減小各步的測(cè)量誤差。 例如：一般分析天平的稱量誤差為+0.0001g，用減重法稱量?jī)纱?，可能引起的最大誤差是+0.0002g，為了使稱量的相對(duì)誤差小于0.1%，取樣量就不能小于0.2g。 （3）消除測(cè)量中的系統(tǒng)誤差 A、校準(zhǔn)儀器：對(duì)砝碼、滴定管和移液管進(jìn)行校準(zhǔn)。 B、做對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣或純物質(zhì)當(dāng)樣品進(jìn)行分析，由分析結(jié)果和其已知含量的差值，確定分析的誤差。 C、做空白實(shí)驗(yàn)：在不加樣品的情況下，以與樣品相同的方法、步驟進(jìn)行分析，把所得的結(jié)果

12、作為空白值從樣品分析結(jié)果中減去。這樣可以消除由于試劑不純或容器不符合要求所帶進(jìn)的誤差。8.有效數(shù)字 有效數(shù)字是指分析工作中實(shí)際測(cè)到的數(shù)字，允許最后一個(gè)數(shù)字是可疑數(shù)，反映測(cè)量值的準(zhǔn)確度，要與測(cè)量的方法相適應(yīng)。 一般分析數(shù)據(jù)保留4位有效數(shù)字，保留的位數(shù)太多無實(shí)際意義，反而增加計(jì)算的麻煩。要注意0.0052的有效數(shù)字只有2位，3個(gè)0是用于定位的無效數(shù)字。 修約有效數(shù)字的原則是四舍六入五成雙。如23.455±0.546修約為23.46±0.55， 28.445±0.675修約為28.44±0.68，要避免出現(xiàn)0.00002±0.00001之類的數(shù)字，或

13、3658.2543±0.0058之類的數(shù)字。五、生物化學(xué)常用緩沖液（一）基本概念 Bronsted-Lowry酸堿理論（酸堿質(zhì)子理論）: 1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Brnsted和英國(guó)化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl-等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對(duì)應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl- H+ HCl是酸，Cl-是它的共軛堿。 pH = pKa+l

14、og質(zhì)子受體/質(zhì)子供體 緩沖體系的設(shè)計(jì)： 1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性： pKa值在6-8之間； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 鹽效應(yīng)小； 離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響小； 不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀； 該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定； 紫外和可見光波長(zhǎng)范圍內(nèi)光吸收小； 易制得高純度的鹽。（二）生物化學(xué)常用緩沖液 磷酸鹽緩沖液： 磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa

15、17.21， pKa212.32 配酸性緩沖液： 用NaH2PO4，pH1-4， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH6-8， 配堿性緩沖液： 用Na2HPO4，pH10-12。 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為： 容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的pH范圍寬； pH受溫度的影響?。?緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。其缺點(diǎn)為： 易與常見的鈣Ca+離子、鎂Mg+離子以及重金屬離子締合生成沉淀； 會(huì)

16、抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液： Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH7.5-8.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH5.0-9.0Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： 因?yàn)門ris的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液； 對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其

17、缺點(diǎn)是： 緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1； 溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，例如：4時(shí)緩沖液的pH8.4，而37時(shí)的pH7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0-4。 易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 有機(jī)酸緩沖液： 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是： 所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物

18、，因而對(duì)生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用； 檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn+、Mg+等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾； 這類緩沖液易與Ca+離子結(jié)合，所以樣品中有Ca+離子時(shí)，不能用這類緩沖液。 硼酸鹽緩沖液： 常用的有效pH范圍是：pH8.5-10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。 氨基酸緩沖液： 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有： 甘氨酸-HCl緩沖液：pH=2.0-5.0， 甘氨酸-NaOH緩沖液：pH=8.0

19、-11.0， 甘氨酸-Tris緩沖液：pH=8.0-11.0，（廣泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.5-6.5， 此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。 其缺點(diǎn)是： 與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。 試劑的價(jià)格較高。 六、 pH值的測(cè)定測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法，最簡(jiǎn)便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。 廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。 精密pH試紙，可以較精確地測(cè)定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個(gè)pH單位，例如

20、有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等許多種，可根據(jù)待測(cè)溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。 測(cè)定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對(duì)照，估讀出所測(cè)pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。 紫外可見分光光度法一、基本原理（一）Beer-Lambert 定律 當(dāng)一束單色光通過溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就會(huì)減弱。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強(qiáng)度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強(qiáng)度則減小。透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，稱為

21、透光度(transmittance)，以T表示。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)液層厚度b和溶液濃度c按算術(shù)級(jí)數(shù)增加時(shí)，透光度T按幾何級(jí)數(shù)減小，數(shù)學(xué)式為： A-lgTabc A：吸光度，又稱光密度“O.D”；T：透光度， TI / I。； a：吸光系數(shù)（L·mol1·cm1）；比例常數(shù)，稱吸光系數(shù) b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，則b=1cm； c：樣品濃度（mol/L）。吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡(jiǎn)稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=abc 吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性： 即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該

22、波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。 若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定 260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2×103 M-1cm，計(jì)算其摩爾濃度。 L）。 AbC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1×10-5 mol / L吸收池使用注意事項(xiàng)： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在 1洗潔凈液中

23、浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。三、分光光度法的定性與定量方法（一）定性方法： 一系列不同波長(zhǎng)的單色光照射待測(cè)溶液，可測(cè)的一系列相應(yīng)的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作圖，可以得到待測(cè)物質(zhì)的吸收曲線。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較而定性。 （二）定量方法： 根據(jù)比爾定律，物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與濃度之間有線性關(guān)系。因此，只要選擇一定的波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度，即

24、可求出濃度。1.吸光系數(shù)法（絕對(duì)法）： 根據(jù)比爾定律A= c l ，若 l 和吸光系數(shù)或E1%1cm已知，即可根據(jù)測(cè)得的A，求出被測(cè)物的濃度。 C = A / l 通?；駿1%1cm可以在手冊(cè)或文獻(xiàn)中查到。 示例見課本P10.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法: 在有些情況下，如單色光不純等情況，測(cè)得的吸光值隨所用儀器不同而有相當(dāng)大的變化。若此時(shí)用吸光系數(shù)換算成濃度，將產(chǎn)生很大的誤差。 但如果只用一臺(tái)固定的儀器，則可認(rèn)定在固定的工作狀態(tài)和測(cè)定條件下，濃度與吸光度之間的關(guān)系在許多情況下是線性關(guān)系或接近于線性關(guān)系。 A=KC(K只為比例常數(shù)，而非物質(zhì)常數(shù)） 依據(jù)上式的關(guān)系進(jìn)行定量是分光光度法中比較簡(jiǎn)便易行的方法。標(biāo)準(zhǔn)

25、曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）在測(cè)定條件相同的情況下，分別測(cè)定其吸光度。（3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。（4）在相同條件下測(cè)出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。離心機(jī)的使用1.使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過各個(gè)離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。 2.離心前必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭各孔內(nèi)有無異物。 3.若

26、要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。4.裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。5.離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察離心機(jī)上的儀表是否正常

27、工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時(shí)排除故障。 6.每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時(shí)，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時(shí)間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時(shí)，則須按規(guī)定降速使用。 7.離心時(shí)不準(zhǔn)開蓋，不準(zhǔn)用手停止轉(zhuǎn)頭。移液器的使用 設(shè)定移液體積從大體積調(diào)節(jié)到小體積時(shí)，為正常調(diào)節(jié)方法，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度即可；從小體積調(diào)節(jié)至大體積時(shí)，可先順時(shí)針調(diào)至超過設(shè)定體積的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，這樣可以保證最佳的精確度。 裝配移液器吸頭 單道移液器，將移液端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)，上緊即可用移液器反復(fù)撞擊吸頭來上緊的方法是不可取的，這樣操作會(huì)導(dǎo)致移液器

28、部件 因強(qiáng)烈撞擊而松散，嚴(yán)重的情況會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡住。 多道移液器，將移液器的第一道對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)吸頭，傾斜插入，前后稍許搖動(dòng)上緊，吸頭插入后略超過O型環(huán)即可。 養(yǎng)護(hù)： 1、如液體不小心進(jìn)入活塞室應(yīng)及時(shí)清除污染物； 2、移液器使用完畢后，把移液器量程調(diào)至最大值，且將移液器垂直放置在移液器架上； 3、根據(jù)使用頻率所有的移液器應(yīng)定期用肥皂水清洗或用 60 的異丙醇消毒，再用雙 蒸水清洗并晾干； 4、避免放在溫度較高處以防變形致漏液或不準(zhǔn)； 5、發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)找專業(yè)人員處理。 注意事項(xiàng) 1、當(dāng)移液器吸嘴有液體時(shí)切勿將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞； 2、正確使用移液器吸液、排

29、液，以達(dá)高精準(zhǔn)度。尤其注意排液的 2) 、 3) 操作； 3、平時(shí)檢查是否漏液的方法： 吸液后在液體中停 1-3 秒觀察吸頭內(nèi)液面是否下降；如果液面下降首先檢查吸頭是否有問題，如有問題更換吸頭，更換吸頭后液面仍下降說明活塞組件有問題，應(yīng)找專業(yè)維修人員修理。 4、 需要高溫消毒的移液器應(yīng)首先 查閱所使用的移液器是否適合高溫消毒后再行處理。酪蛋白的制備原理：等電點(diǎn)沉淀（選擇性沉淀）利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的性質(zhì)。注意： 調(diào)節(jié)溶液到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，可以使蛋白質(zhì)溶解度最低，但是并不意味著蛋白質(zhì)會(huì)沉淀出來。40水浴預(yù)熱10分鐘（HAC緩沖液同時(shí)預(yù)熱）用滴管加入HAC緩沖液約2ml（pH 4.8）離

30、心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘1、布朗運(yùn)動(dòng)加速蛋白分子的碰撞2、等電點(diǎn)附近蛋白質(zhì)的溶解度最低用4ml蒸餾水洗滌離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘除去沉淀中的可溶部分95%乙醇洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘除去沉淀中的脂類物乙醚2ml洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘脫水0.1N NaOH 2ml溶解加水至10ml酪蛋白是酸性蛋白質(zhì)，溶解于堿性溶液中，方便下次雙縮脲法測(cè)定牛乳2ml40水浴預(yù)熱10分鐘（HAC緩沖液同時(shí)預(yù)熱）用滴管加入HAC緩沖液約2ml（pH4.8）離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘清液沉淀清液沉淀清液沉淀清液沉淀用4ml蒸餾水洗滌離心，3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘95%乙醇洗滌離心，2

31、500轉(zhuǎn)/分，10分鐘乙醚2ml洗滌離心，2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘0.1NNaOH2ml加水至10ml待測(cè)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法3. 掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析2主要方法： （1）比較吸收光譜曲線 （2）比較最大吸收波長(zhǎng)蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm（3）比較吸光度的比值（二）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析1原理Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KC

32、L其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度2常用方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法§ 標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。（2）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測(cè)定AS、AX，可求得CX。（3）摩爾吸光系數(shù)法C=A/e（e為L(zhǎng)=1cm，C為1 mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。3.樣品測(cè)試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上 打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路 蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“

33、100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A 將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù)實(shí)驗(yàn)完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。肝臟DNA的粗提取n 破碎細(xì)胞n 提取核蛋白n DNA核蛋白和RNA核蛋白分離n 蛋白和核酸分離原則n 低溫：抑制DNA酶的活性n 操作柔和：防止DNA斷鏈DNA分離純化的原理n DNA或DNP在0.14MNaCl鹽溶液中溶解度很低，而RNA則溶

34、于0.14MNaCl鹽溶液，利用這一性質(zhì)可將生物組織中的DNA與RNA分開n DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取脫氧核糖核蛋白復(fù)合物-DNP后，必須將其中蛋白去除n 其中蛋白質(zhì)部分可用SDS使之變性除去（同時(shí)破壞核酸分解酶）。n 進(jìn)一步純化則利用氯仿-異戊醇震蕩除蛋白，震蕩時(shí)，蛋白質(zhì)變性，形成凝膠，并與DNA分開，DNA則留在水層中。n 利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇將DNA 從溶液中沉淀出來。離心機(jī)的使用n 平衡n 對(duì)稱放入，蓋上蓋n 設(shè)定轉(zhuǎn)速、時(shí)間n 離心開始n 完全停止后開蓋實(shí)驗(yàn)步驟n 1、取新鮮豬肝4g，用0.14mol/L NaCl 0.15mol/LEDT

35、A溶液洗去血液，剪碎。加入10ml 0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，置勻漿器中研磨。（初步破碎細(xì)胞）。（已做）n 2、取一支5mlEP管，裝入糊狀物（基本裝滿），離心5min（10000rpm），棄去上清液n 沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/l EDTA溶液洗三次。每次加入溶液后用吸管吹打均勻再離心（同上），直到上清液無血細(xì)胞。n 棄上清液，所得沉淀為DNP（DNA蛋白復(fù)合物）粗制品n 3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液5ml，分裝于2支10mlEP管，然后每管滴加25%SDS溶液0.5mL，邊

36、加邊振蕩。加畢，置60水浴20min （不停振蕩），直至溶液變得粘稠并略透明，取出冷卻至室溫。此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。 n 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液1mL，蝴蝶形振蕩5min。加入約1倍體積的氯仿異戊醇混合液，蝴蝶形振蕩10min，離心10min（4000rpm）。 n 此步驟后溶液分三個(gè)相：上層水相（DNA）；中層變性蛋白質(zhì)相；下層有機(jī)相和殘余的RNA。 n 5、吸出上清液，棄去沉淀。向上清液中緩慢加入1.52倍體積的95%乙醇，DNA沉淀析出，離心（4000rpm）10分鐘n 用玻棒攪出的絲狀物則為粗DNA血糖的測(cè)定原理 無蛋白血濾液 葡萄糖 堿性銅試劑 Cu(OH) 2

37、 磷鉬酸試劑 磷鉬酸 葡萄糖 Cu(OH)2 Cu2O Cu2O 磷鉬酸 鉬藍(lán)鉬藍(lán)的藍(lán)色深淺與葡萄糖的含量成正比,用比色法可測(cè)定血糖的含量 操作 ?臨床意義 （mg/dl） 正常懷疑糠尿病 空腹血糖110110-139140 餐后兩小時(shí)血糖140140-199200 服糖后兩小時(shí)糖140140-199200 1、 無蛋白血濾液的制備：取干試管一支，準(zhǔn)確加入蒸餾水3.5ml，血液0.1ml，2/3NH2SO40.2ml，10Na2WO4 0.2ml，混勻，待有澄清液出現(xiàn)后，過濾，收集濾液備用編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（1.0ml = 0.025mg）2.0無蛋白濾液（ml）2.0蒸餾水（

38、ml）2.0堿性銅試劑（ml）2.02.02.0充分搖勻，置沸水浴準(zhǔn)確煮沸8分鐘，取出切勿搖動(dòng)，置于冷水浴冷卻磷鉬酸試劑（ml）2.02.02.0混勻，放置3分鐘蒸餾水（ml）3.03.03.0 將各試管搖勻后，用紅色濾光片或620nm，以空白管校零點(diǎn)，比色。課后思考題 Folin-吳法測(cè)定血糖的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ 進(jìn)行比色法測(cè)定時(shí)，如果測(cè)得樣品的A值超過100%，該如何處理，為什么？質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌 掌握：質(zhì)粒DNA提取的原理和方法；l 熟悉：堿裂法提取質(zhì)粒的基本操作步驟；l 了解：質(zhì)粒小抽提取試劑盒的組成和實(shí)驗(yàn) 原理。 實(shí)驗(yàn)原理l 在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)

39、菌染色體DNA變性，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然氫鍵也發(fā)生斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)緊密纏繞結(jié)合在一起。 l 將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性，仍然為可溶狀態(tài)。l 通過離心，可去除大部分細(xì)胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，分離上清，用兩倍體積乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)步驟加5mL培養(yǎng)物于10 mL EP管，12000 r/min×2min 除去上清，加入100 µL 溶液I，中懸浮細(xì)菌沉淀，并轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中。 加入

40、200µL 溶液II，快速顛倒數(shù)次，冰浴2 min 加入150µL 溶液III，溫和振蕩10s，冰浴5min，12000 r/min×5min轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿 /異戊醇，溫和振蕩，抽提2次，12000r/min×2min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無水冰乙醇（-20 冰箱中放置），顛倒混勻，12000r/min´10 min  棄上清，沉淀中加1 mL70%乙醇，12000g×2min 去上清，沉淀物于37 恒溫箱中干燥至透明狀，后于 - 20 保存、待用。主要試劑及作用溶

41、液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護(hù)、緩沖) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（懸浮細(xì)胞） EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子, 防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用） Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性) SDS：？ NaOH（pH>12）：破壞細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞溶液III：HAc和 KAc組成的高鹽溶液 (復(fù)性，分離) HAc溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。 KAc會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中

42、的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 l 。 PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）概述（一）概念 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。 二、PCR反應(yīng)的原理和步驟PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，

43、以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3、引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的片段富集106109倍。所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈

44、指數(shù)上升。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期。PCR反應(yīng)體系的主要成分和作用l DNA聚合酶l 模板l 引物l dNTPl 緩沖體系（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶來源于嗜熱水生菌的重組體，與一般的聚合酶所不同的是在高溫狀態(tài)仍具有活性。 可分為兩大類： 1、具有校正功能的（有35核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （無3 5核酸酶活性） 比如：一般的Taq

45、 DNA聚合酶（二）模板 核酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 （三）引物 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。*(六）PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系 五、PCR的反應(yīng)條件控制（

46、一）PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間控制 1、變性溫度與時(shí)間 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間 退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510) 在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性