醫(yī)學科研思路與方法期末考試設計報告模板

1、醫(yī)學科研設計報告書研究名 稱：迷走反射調(diào)節(jié)胰腺分泌的神經(jīng)傳遞機制研究作者：王二、李四班級：電話：電子信箱(Email):日期：2012年5月1日、立論依據(jù)(包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處)對基礎研究，著重結(jié)合國際科學發(fā)展趨勢，論述項目的科學意義； 對應用基礎研究，著重結(jié)合學科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應用情景。餐后胰腺分泌是食物消化吸收過程中的重要組成部分，目前認為這一過程主要由內(nèi)分 泌激素膽囊收縮素(CCK)及迷走-迷走反射作用于胰腺的迷走神經(jīng)膽堿能節(jié)后神經(jīng)調(diào)節(jié) 1-3。但餐后迷走神經(jīng)信號的上傳、中樞整合后控制胰腺分泌信號的下傳神經(jīng)通

2、路及在這一 通路中參與的神經(jīng)遞質(zhì)還未闡明，病理研究證實迷走神經(jīng)初級傳入纖維位于腸上皮以下粘 膜固有層內(nèi)，提示腸道接受刺激后并不直接作用于迷走神經(jīng)傳入纖維，而通過間接途徑起 作用。5羥色胺(5-HT )為傳遞內(nèi)臟感覺的神經(jīng)遞質(zhì)，美國Michigan大學胃腸肽研究中心報道迷走神經(jīng)初級傳入纖維含有大量CCK-A及5-HT3受體，腸道內(nèi)的刺激，如碳水化合物、高滲鹽水及粘膜磨擦等，可導致腸粘膜嗜鉻細胞(EC)釋放5-HT，繼而作用于迷走傳入神經(jīng)末梢的5- HT3受體，引起迷走反射主導的胰腺分泌4-6。迷走感覺神經(jīng)元細胞內(nèi)電生理記錄進一步發(fā)現(xiàn)5-HT與CCK可能協(xié)同作用刺激迷走神經(jīng)傳入纖維。然而這種信號如

3、何上傳以及參與其傳遞過程的神經(jīng)遞質(zhì)仍不清楚。迷走神 經(jīng)節(jié)(vagal nodose ganglia )及孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)為迷走傳入的重要 部位。迷走神經(jīng)節(jié)及孤束核內(nèi)均有多種神經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸鹽(glutamate, Glu)及P物質(zhì)(substanee P, SP)在迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)合成并釋放至孤束核8，而起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用。Glu及SP是否參與腸道刺激后迷走神經(jīng)的信號傳入尚未見報道。我們推測腸道刺激后，腸道EC細胞釋放5-HT , 5-HT作用于迷走初級傳入神經(jīng)末梢的5HT3受體，興奮迷走傳入神經(jīng)，將信號傳至迷走神經(jīng)節(jié)，迷走神經(jīng)節(jié)利

4、用 Glu及SP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)將信號傳至孤束核。因此，在本研究的前半部分，我們將通過腸腔刺激觀察迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)興奮性神經(jīng) 元神經(jīng)遞質(zhì)Glu及SP的表達，并通過神經(jīng)元細胞內(nèi)電生理記錄證實Glu及SP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)參與信號上傳。同時孤束核內(nèi) Glu及SP受體表達增加，電生理記錄確定興奮性神經(jīng)元，通過神經(jīng)元染色證實迷走傳入神經(jīng)將Glu主SP作為興奮性遞質(zhì)將外因刺激的信號傳至中樞。中樞對胰腺分泌功能的調(diào)節(jié)主要是通過迷走運動背核( dorsal motor nucleus, DMN )發(fā) 出的副交感 運動神 經(jīng)起作用。以往 零星的研究發(fā)現(xiàn)DMN 微量注 射甲狀腺素激素 (thyrotropin-r

5、eleasing hormone, TRH )能刺激胰腺分泌9，而胰多肽(pancreatic polypeptide, PP)則能抑制胰腺分泌10。腦內(nèi)注射生長抑素(somatostatin, SS)、鈣調(diào)基因相關(guān)肽(calcitonin gene-regulated peptide, CGRP)及胰高血糖素類似肽( Glucagon-like-peptide-1, GLP-1 )亦對 胰腺分泌有抑制作用11-13。但各種中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胰腺分泌的作用通路，它們對迷走傳 出神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)、對胰腺內(nèi)神經(jīng)元的調(diào)控，以及特定神經(jīng)遞質(zhì)對胰腺分泌的特異性調(diào)節(jié) 作用尚未見報道。DMN的迷走傳出神經(jīng)對胰腺

6、分泌的調(diào)控是非常復雜的，其一方面接受 NTS的傳入信息，另一方面也接受高級中樞的控制14，此外，血循環(huán)中一些內(nèi)分泌因素可通過血腦屏障薄弱處直接作用于DMN 15。我們認為，DMN迷走傳出神經(jīng)對胰腺功能的調(diào)-2-節(jié)是眾多興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)綜合作用的結(jié)果，迷走神經(jīng)傳出纖維作用于胰腺內(nèi)神經(jīng)，后者綜合各種中樞信息，調(diào)節(jié)胰腺功能。研究發(fā)現(xiàn)DMN迷走傳出神經(jīng)有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、NOS及各種神經(jīng)肽(VIP、NPY、GRP)等16，因此，我們推測特定的刺激可以作用于某一組迷走運動神經(jīng)元，它們有特定的神經(jīng)遞質(zhì)，這些傳出纖維作 用于具有不同的特有神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi)神經(jīng)元，從而調(diào)控不同的胰腺功能。

7、綜上所述，雖然以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道刺激后，腸粘膜EC釋放5-HT，作用于迷走傳入神經(jīng)末梢5-HT3受體最終引起胰腺的分泌，但這種刺激上傳通路及參與的神經(jīng)遞質(zhì)均 不明確。DMN內(nèi)微量注射某些神經(jīng)遞質(zhì)已證實對胰腺的分泌功能有興奮或抑制作用，但中樞傳出對胰腺分泌的調(diào)控通路及其相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)尚不清楚。因此，我們設計了本研究， 希望能初步確定腸道刺激引起胰腺分泌的一個完整的神經(jīng)通路，即腸道刺激激發(fā)迷走傳入 沖動到NTS，DMN傳出沖動到胰腺調(diào)節(jié)胰腺分泌功能。這一研究將證實存在腦-胰通路(Brai n-Pa ncreas In teraction )的假說，豐富對胰腺分泌調(diào)節(jié)機制的認識，對胰腺疾病的救

8、治具有重要的意義。參考文獻1. Li Ying, Owyang C. Endogenous cholecystokinin stimulated pancreatic enzyme secretion via a vagal afferent pathway. Gastroenterology, 1994;107(2):525-5312. Li Ying, Hao Y, Owyang C. High-affinity CCK-A receptors on the vagus nerve mediates CCK-stimulated pancreatic secretion in rats.

9、Am J Physiol, 1997;273(3Pt1):G679-G6853. Li Ying, Owyang C. Pancreatic secretion evoked by cholecystokinin and non-cholecystokinin-dependent duodenal stimuli via vagal afferent fibers in rat. J Physiol, 1996;491(3):773-7824. Li Ying, Hao YB. Zhu JX, Owyang C. Serotonin released from intestinal EC ce

10、lls mediate luminal non-CCK stimulated pancreatic secretion in rats. Gastroenterology, 2000;118(6):1197-12075. Li Ying, Hao YB, Zhu JX, Owyang C. Intestinal serotonin acts as a paracrine substance to mediate pancreatic secretion stimulated by non-CCK dependent luminal factors. Am J Physiol, 2001;281

11、(4):G916-G9236. Zhu JX, Wu XY , Owyang C, Li Ying. Electrophysiological evidence that intestinal 5-HT acts as a paracrineto mediate vagal signal transmission evoked by luminal factors in the rat. J of Physiol, 2001;530(3):431-4427. Li Ying., Wu YX, Owyang C. Serotonin and cholecystokinin synergistic

12、ally stimulate at vagal primary afferent neurons. Gastroenterology, 2001;120(5):A38328. Granata AR, Sved AF, Reis DJ. In vivo release by vagal stimulation of L-(3H) glutamic acid in the nucleous tractus solitarius preloaded with L-(3H) glutamine. Brain Res Bull, 1984;12(1):5-9.9. Okumura T, Taylor I

13、L, Pappas TN. Microinjection of TRH analogue into the dorsal vagal complexstimulates pancreatic secretion in rats. Am J Physiol, 1995;269(3Pt 1): G328-34二、研究方案1. 研究目標、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標腸道接受刺激后，迷走感覺神經(jīng)利用谷氨酸鹽（Glu）、P物質(zhì)（SP）作為神經(jīng)遞質(zhì)。研究內(nèi)容腸道刺激后，迷走感覺神經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞機制 利用c-Fos的表達確定腸道接受各種刺激（碳水化合物、高滲鹽水、5-HT）后，迷走神經(jīng)節(jié)（vagal

14、no dose gan glia）內(nèi)的迷走感覺神經(jīng)元； 通過免疫組化雙重染色，觀察c-Fos陽性神經(jīng)元Glu及SP的表達，說明腸道刺激后迷走感覺神經(jīng) Glu及SP表達增加。擬解決的關(guān)鍵問題迷走神經(jīng)節(jié)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)電生理記錄迷走神經(jīng)節(jié)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射孤束核內(nèi)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)電生理記錄孤束核內(nèi)迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射迷走運動背核內(nèi)微量注射法迷走神經(jīng)胰腺枝電生理記錄雙重免疫熒光標記4-2. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法利用c-Fos表達陽性確定迷走神經(jīng)節(jié)、孤束核、迷走運動背核及胰腺內(nèi)迷走感覺神經(jīng)利用免疫組化雙重染色研究迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)c-Fos陽性神經(jīng)元Gl

15、u、SP等神經(jīng)遞質(zhì)表達利用熒光免疫組化雙重染色研究孤束核內(nèi)c-Fos陽性神經(jīng)元Glu受體及SP受體表達通過迷走感覺細胞的電生理記錄，確定腸道刺激后被興奮的迷走感覺神經(jīng)元，免疫組化雙重染色確定這些迷走感覺神經(jīng)元利用Glu及SP作為神經(jīng)遞質(zhì)。熒光免疫組化雙重染色研究孤束核內(nèi)被興奮神經(jīng)元Glu受體及SP受體表達技術(shù)路線腸道刺激后迷走感覺神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞機制可行性分析課題組已取得本研究初步預實驗結(jié)果： 腸腔灌注后，迷走神經(jīng)節(jié)c-Fos表達增加，免疫組化雙重染色提示 c-Fos陽性神經(jīng) 元內(nèi)Glu表達增加（圖1） 已建立迷走神經(jīng)節(jié)電生理記錄方法（圖 2），腸腔灌注5-HT后迷走神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng) 元放電增加

16、（圖3） 已完成迷走感覺神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)微粒注射方法，雙重免疫組化染色顯示迷走神經(jīng)元 中富含SP （圖4） 腸道灌注刺激后，孤束核內(nèi)神經(jīng)元c-Fos表達增加，免疫組化雙重染色提示c-Fos陽性神經(jīng)元Glu受體表達明顯增加（圖 5） 孤束核內(nèi)微量注射 Glu受體阻斷劑可減少腸腔灌注5-HT后胰腺分泌（圖6） 胰腺內(nèi)注射熒光標記 CTB，逆向追蹤至迷走運動指核，見CTB免疫熒光陽性神經(jīng)元，神經(jīng)元內(nèi) ChAT、c-Fos、NK1受體表達增加（圖 79） 建立迷走神經(jīng)胰腺枝電生理記錄方法，迷走運動指核內(nèi)注射 NPY后電活動明顯增加（圖10） 迷走運動背核內(nèi)微量注射SP,胰腺內(nèi)神經(jīng)元c-Fos表達增加，c-

17、Fos陽性神經(jīng)元內(nèi)ChAT表達增加（圖11）上述預試驗結(jié)果表明，課題組已掌握了完成本研究的關(guān)鍵技術(shù)，能夠成功解決關(guān)鍵問題。3. 本項目的特色和創(chuàng)新之處本研究使用的免疫組化雙重染色及多重染色技術(shù)、活體內(nèi)電生理記錄技術(shù)均為當今世界先進的技術(shù)，結(jié)合胰腺分泌功能的研究將確定一個完整的神經(jīng)通路，即腸道刺激激發(fā)迷 走傳入沖動到孤束核，迷走運動背核傳出沖動到胰腺調(diào)節(jié)胰腺分泌功能。這一研究將證實 存在腦胰通路（Brai n-Pa ncreas In teraction ）的假說，豐富對胰腺分泌調(diào)節(jié)機制的認識。7 4. 年度研究計劃及預測進展20012年1月2012年12月（第一年度） 腸道刺激后迷走神經(jīng)節(jié)c-

18、Fos表達 c-Fos陽性神經(jīng)元Glu、SP表達 腸道刺激后迷走神經(jīng)節(jié)電生理記錄 迷走神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)微粒標記及Glu、SP表達 腸道刺激后孤束核 c-Fos表達 c-Fos陽性神經(jīng)元Glu、SP表達2013年1月2013年12月（第二年度） 腸道刺激孤束核神經(jīng)電生理記錄 孤束核內(nèi)神經(jīng)元微粒標記及Glu受體、SP受體表達 孤束核內(nèi)微量注射 Glu受體阻斷劑對胰腺分泌的調(diào)節(jié) 胰腺內(nèi)注射，逆向追蹤，迷走運動背核c-Fos表達 c-Fos陽性神經(jīng)元ChAT、Glu受體及SP受體的表達2014年1月2014年12月（第三年度） 迷走運動背核微量注射對迷走神經(jīng)胰腺枝電生理作用及胰腺分泌功能的影響 迷走運