聚合酶鏈反應(PCR)技術的操作及醫(yī)學中應用

1、聚合酶鏈反應(pcr)技術的操作及醫(yī)學中應用(黑龍江省農墾總局總醫(yī)院黑龍江哈爾濱150088)【摘要】聚合酶鏈反應(pcr)是一種在試管進行的簡便而快速的特異性dna 體外擴增技術，其基木原理與細胞內dna復制的相似，但反應體系相對比較簡 單。主要應用于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能及時準確檢出或敏感性太低或培養(yǎng)時間長的病 原體的檢測。pcr擴增能力極強、靈敏性極高，微量的樣品污染便有可能導致假 陽性結果的出現(xiàn)，為此，在實驗操作中應謹防污染的發(fā)牛，并設置嚴格的對照, 以提高pcr結果的正確性?！娟P鍵詞】聚合酶鏈反應技術；pcr;操作方法；應用【中圖分類號】r319【文獻標識碼】a【文章編號】1007-823

2、1 (2016) 14-0229-02聚合酶鏈反應(pcr)技術是近年來發(fā)展起來的一種選擇性體外擴增dna或 rna片段的方法。此法操作簡單，可在數(shù)小時內對僅有幾個拷貝的基因擴增放大 百萬倍。目前，pcr技術己滲透到分子生物學等的各個領域，在分子克隆、遺傳 病的基因診斷、法醫(yī)學等方面得到了廣泛應用。1. pcr技術的基木操作1.1 pcr基木操作1.1.1標準的pcr體系 體積一般選用50100μl,其中含有50mmol/l kci, lommol/ltris cl(室溫下 ph 值 8.3), 1.5mmol/l mgci2, loommol/ml 明膠或 牛血清清蛋白(bsa

3、),上、下游引物各lμmol/l, 4種dntp混合物各 200μmol/l,模板 dna 102105 個拷貝，taq dna 聚合酶 2.5u。1.1.2操作程序 按以下程序，將各成分在0.5ml滅菌離心管內混合(按 100&mu兒反應體積計算)混勻后離心15s使反應成分沉至管底。加石蠟油50 loogl于反應液表面以防液體蒸發(fā)。置反應管于9597°c變性510min,冰 浴冷卻,加入taq dna聚合酶(5u/μl) 0.5μlo于合適的溫度和時間下 進行循環(huán)2530次。末次循環(huán)后，在延伸溫度下再延吋57min。反

4、應結束后， 短暫離心，吸取少量反應液進行電泳分析，剩余液體置4°c保存?zhèn)溆谩?. pcr擴增產物的分析法根據研究對象和目的的不同，可采用不同分析法對pcr擴增產物進行分析。2.1凝膠電泳分析法pcr產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，后者靈敏度遠高于 前者，但配制方法復雜，故常用前者。做瓊脂糖凝膠電泳時可用單一瓊脂糖凝膠 來分析，亦可使用混合低熔點瓊脂糖凝膠，此種混合膠的熔點低（65°c）,而強 度增加，易于操作，但低熔點瓊脂糖過于昂貴2。在配制瓊脂糖吋加入 0.5μg/ml的澳化乙錠（etbr）或電泳后凝膠用同樣濃度的etbr液染色20min, 然

5、后用去離子水漂洗2次，每次15min,于uv燈下觀察結果并拍照。凝膠電泳 不僅可鑒定產物的大小，檢測擴增情況，還可用于純化擴增產物。2.2斑點雜交分析法當擴增產物為多條帶時用斑點雜交較合適。將pcr擴增產物固定于尼龍膜或 硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標志物標記的與產物部分或全長核昔 酸序列互補的探針進行雜交。點雜交不僅可提高檢測靈敏度（提高約一個數(shù)量級）, 而且還有助于檢測突變dna的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分 析。放射性核素（32p、35s等）標記的寡核昔酸探針檢測的靈敏度高、特異性好u 方法可靠，但由于放射性核素不穩(wěn)定口有放射性危害，所以，不能用于臨床或法 醫(yī)學的

6、常規(guī)檢測3。而用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的 寡核昔酸探針分析pcr產物可達到與放射性核素標記法相似的靈敏度，且非放射 性標志物穩(wěn)定性高，使用方便安全，檢測速度快。2.3微孔板雜交法有兩種方法。一種是夾心雜交法，即通過一固定于微孔板的捕獲探針與pcr 產物的某一區(qū)域特異雜交，使產物間接地固定于微孔板上，然后再用生物素等非 放射性標志物標記的檢測探針與產物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果。 另一種方法不是采用夾心雜交法，而是直接將特異探針固定于微孔板上，然后用 生物素標記的pcr產物與之雜交。該法與膜印跡雜交相比具有易操作、漂洗吋間 短、本底低等優(yōu)點。3. pcr技術在醫(yī)

7、學中的應用pcr可廣泛應用于各生物學領域。擴增各種基因,用于基因重組、蛋白表達、 構建cdna文庫，目前所用的基因工程生物產品，絕大多數(shù)是通過pcr方法獲得 的目的基因。測序，可以很快測出常規(guī)pcr產物或單鏈dna的序列。用于分 子進化和種系發(fā)育的研究，因為在一-些大分子序列中含有足夠的進化信息，通過 pcr對其編碼基因的擴增，并與較近或較遠的種系比較，研究其分子進化及種系 發(fā)育4。分析和診斷遺傳性疾病，根據遺傳性疾病基因的缺失或突變對其做出 診斷，如甲型血友病、苯丙酮尿癥和地中海貧血等。hla基因的多態(tài)性分析， 用于器官移植的配型等?；蛲蛔兒椭亟M研究，闡明基因突變對蛋白質功能的 影響。臨床

8、目前主要是用于感染性疾病的診斷。3.1在感染疾病中的應用在感染性疾病的診斷中，尤其是當血清學不能明確判斷吋，pcr可以確證感 染的存在：各種傳染性疾病均可進行病原學確證診斷，但如果能用血清學方法 診斷的病原體感染，一般不用pcr方法診斷。對病原體進行基因分型和同源性 比較，研究病原體的地區(qū)分布、基因變異，從而指導臨床治療?？寺〔≡w各 種蛋白質的基因，用于蛋白表達，純化后制備血清學診斷試劑或疫苗。發(fā)現(xiàn)新 的病原體，如hcv、hbv、ttv和senv。通過對未知病原體肝炎患者的血清進行 隨機引物pcr擴增，將擴增產物的序列與其他已知病原體基因序列比較而發(fā)現(xiàn)新 病原體?？寺〔≡w各種基因，建立基因

9、表達載體，用于基因治療。3.2 pcr在診斷病原體感染吋的優(yōu)缺點pcr在對病原體感染的診斷方面有許多其他診斷方法無法比擬的優(yōu)點，但也 存在一定的不足之處。3.2.1優(yōu)點 靈敏度高。理論上，只要標本中有一個分子的dna或rna就 可以做出診斷,hbv感染的診斷中，在適合的條件下pcr的敏感性為100份/ml, 而斑點雜交的敏感性為105份/ml。特異性強。對于一個有20個核昔酸的引物 來說，非特異性配對的概率為1/420o pcr可以克服血清學診斷有交叉反應的缺 陷?？梢栽缭\斷。例如，在hcv感染中，第一周內就可通過pcr檢測岀hcvrna, 而抗體的產生一般在第二周以后。對免疫力低下或使用免疫抑制劑而無抗體產 生者，pcr可以做出明確診斷。對病原體可定量分析，反映病原體在機體內的 復制及動力學變化，并可對病原體進行基因分型及其觀察，指導臨床治療。3.2.2不足之處 操作復雜，技術不易被熟練掌握；價格昂貴；由于 敏感度高，操作步驟多而復雜，常有污染情況發(fā)生，即使污染極少也會造成假陽 性，稍有差錯就會出現(xiàn)假陰性。?？苹嘤栐诘湍曩Y護士培訓中的應用【參考文獻】1張捷定量聚合酶鏈反應技術及在臨床實驗室應用的價值卩中華檢驗醫(yī)學 雜志,2001.24(1):60-61.蕭劍鋒，唐北沙，謝光潔，肖波，夏家輝聚合酶鏈反應技術在腓骨肌