微生物藥物研究開題報告

1、曲靖師范學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計）開題報告論文題目： 作 者:姜洪波學(xué)號:.2012162123學(xué) 院:生物資源與食品-工程年 級:2012.級專 業(yè):生物科學(xué)指導(dǎo)教師:.ffll:蓮職稱：-進師r 期：2016 年 3 月 26 r畢業(yè)論文（設(shè)計）開題報告填寫說明1. 封面上的“論文題目”一欄填寫時一律不用書名號；外語學(xué)院學(xué)生的論文（設(shè) 計）題目統(tǒng)一填寫英文題目，不用中文。2. 封面上的“學(xué)號” 一欄統(tǒng)一填寫如：“200313門50”含年級、系別、班級和 學(xué)號順序的數(shù)字。不能填寫為：“63”、“04號”的等樣式。3. 封面頁上的“年級” 一欄用阿拉伯?dāng)?shù)字統(tǒng)一填寫為：“xxxx級”。不能填寫 為

2、：“四年級”、“03級”、“2003”等樣式。4. 封面頁上的“日期”一欄統(tǒng)一填為帶有年、月、日字樣的日期形式，如“2006 年12月21日”。5. 開題報告用a3紙打印，從中縫對折，其中封面頁有文字信息，封二為"畢 業(yè)論文（設(shè)計）開題報告填寫說明”，封三、封底表格要大小一致。一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀述評（文獻綜述）微生物代謝產(chǎn)物的合成生物學(xué)是一門工程科學(xué)，其所涉及的基礎(chǔ)學(xué)科廣泛，包括數(shù)學(xué)建模、藥 物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、代謝工程、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等。合成生物 學(xué)的概念最初是由hobom于1980年提出用來表述基因重組技術(shù)，所以從狹義角度看合成生物學(xué)技 術(shù)，我們可以

3、認(rèn)為是基因重組技術(shù)，但需要強調(diào)的是合成生物學(xué)針對代謝通路乃至生命系統(tǒng)的重新 設(shè)計和合成，因而目的性強，具體體現(xiàn)在dna、元件（parts） 裝置（dev i ces） 系統(tǒng)（systems）這4 個層面上。微生物代謝產(chǎn)物的合成生物學(xué)最重要的應(yīng)用就是微生物藥物合成（或稱為微生物制藥），其主要 包含來源于微生物（特別是放線菌和真菌）次級代謝產(chǎn)物的藥物。合成生物學(xué)應(yīng)用于微生物藥物合 成的研究對象主要就是微生物和植物來源的次級代謝產(chǎn)物等，因而我們可以從微生物細胞中得到源 于植物細胞的次級代謝產(chǎn)物藥物?？梢姾铣缮飳W(xué)為微生物藥物發(fā)展提供新契機。長久以來，微生物藥物研究中都面臨著兩大挑戰(zhàn)，一是如何將這些與

4、次級代謝產(chǎn)物生物合成相 關(guān)的基因簇“翻譯”（轉(zhuǎn)化）為對應(yīng)的次級代謝產(chǎn)物，二是如何提高次級代謝產(chǎn)物的生物合成水平。 而合成生物學(xué)技術(shù)為解決這兩大問題開辟了道路。我們可以通過對底盤細胞進行遺傳修飾改造，使其細胞環(huán)境有利于編碼異源次級代謝產(chǎn)物生物 合成的基因簇成功表達，而所謂的底盤細胞是指異源表達的宿主細胞，是生物元件、裝置和代謝通 路發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，常常是大腸桿菌、放線菌、鏈霉菌等作為底盤細胞。之所以選擇這些菌 株作為底盤細胞，是因為它們易于培養(yǎng)和遺傳操作容易、生長迅速、發(fā)酵友好及遺傳穩(wěn)定性，又或 是和次級代謝產(chǎn)生菌株的親緣關(guān)系接近。此外，要想使得次級代謝產(chǎn)物成功合成，我們不能單單靠 對底盤

5、的改造，還需要對生物合成基因簇進行加工，例如改變異源生物合成基因簇起始模塊，引入 起始單元。若想使得異源次級代謝產(chǎn)物基因簇高效表達，不妨利用合成生物學(xué)元件，例如基因擴增 元件、耐藥元件、調(diào)控元件，這些元件從不同角度出發(fā)為異源次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的高效 表達發(fā)揮著重要作用。此外，合成生物學(xué)為發(fā)現(xiàn)新次級代謝產(chǎn)物提供了助力。在dna次序技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，結(jié)合 生物信息學(xué)，我們可以越發(fā)觀察到其實微生物細胞基因組中存在著大量與次級代謝產(chǎn)物生物合成相 關(guān)的隱性基因簇，這些沉默基因其實就是構(gòu)造微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑的豐富物質(zhì)基礎(chǔ)。 采用合成生物學(xué)技術(shù)手段在恰當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_沉默的次級代謝通

6、路中的生物合成酶，有可能獲 得用于微生物制藥的新次級代謝產(chǎn)物。不僅如此，我們可以通過合成生物學(xué)技術(shù)對這些沉默基因簇 進行重新設(shè)計重新組裝，往往可以得到新的次級代謝產(chǎn)物，當(dāng)然這就涉及到了生物合成基因簇的加 工。盡管微生物代謝產(chǎn)物的合成生物學(xué)前景備受關(guān)注，但是我們也應(yīng)該高度認(rèn)識到其面臨的問題。 目前，人類對生物體系的認(rèn)識有所局限，無法保證合成生物學(xué)設(shè)計的代謝途徑是否可以發(fā)揮預(yù)期效 果，對設(shè)計代謝途徑所用的模塊元件的特性也沒完全把握。因此，我們需要從基礎(chǔ)做起，真正掌握自 然界特別是微生物的初級與次級代謝的關(guān)系及其調(diào)控機制。在將合成生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物制藥 過程中，需要綜合理性與非理性研究策略，通過

7、反復(fù)替換、測試與篩選，才有可能實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，提 煉得到相應(yīng)次級代謝產(chǎn)物藥物。（一）國內(nèi)研究現(xiàn)狀阿維菌素是一種環(huán)保的綠色農(nóng)藥，易降解且持續(xù)作用時間長，對危害莊稼的昆蟲有較大的殺蟲 效果。此外，它還可以作為抗寄生蟲藥應(yīng)用于畜牧業(yè)。所以，研究人員都在為提高其產(chǎn)量和品質(zhì)而 努力著。合成生物學(xué)技術(shù)可以通過兩方面來提高阿維菌素產(chǎn)量。一方面可以通過設(shè)計合適的底盤來提高 阿維菌素的產(chǎn)量：例如優(yōu)化前體供給配比、提高茵株自身耐藥性等。另一方面可以通過優(yōu)化阿維菌 素的生物合成過程來提高阿維菌素的產(chǎn)量：例如通過不同的啟動子來調(diào)節(jié)各個基因的轉(zhuǎn)錄水平，然 后采用計算機模擬和實驗操作測試對不同轉(zhuǎn)錄水平的各基因組合進行篩選從

8、而獲得最優(yōu)的生物合成 過程。中國科學(xué)院微生物研究所相關(guān)的研究人員，采用合成生物學(xué)大跨度的提高了阿維菌素b1a的產(chǎn) 量1000倍，至9g/l,市場價格由過去的每千克20000元降低到500元。這一成就也使得截止至2015 年9月，中國已經(jīng)成為阿維菌素的唯一生產(chǎn)國。此外，多拉菌素是一種比阿維菌素更好用、更有效的微生物農(nóng)藥，其由經(jīng)基因工程改造后的除 蟲鏈寡菌進行工業(yè)生產(chǎn)，其工業(yè)菌因被國外壟斷，所以多拉菌素在一段時間內(nèi)價格很高。但是，我 國科研人員通過刪除阿維菌素生物合成基因簇中的支鏈酮酸脫氫酶基因bkdf和寡霉素生物合成基 因簇中的起始基因olma1等，構(gòu)造了我國專利的多拉菌素工業(yè)菌株，這對于我國在

9、國際微生物農(nóng)藥 創(chuàng)新競爭力方面起到了重要意義。紅霉素是一種重要的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，只有紅霉素a是有效成分，而在紅霉素a生物合成過 程中會產(chǎn)生中間產(chǎn)物紅霉素b和紅霉素c,因而實際得到的紅霉素品質(zhì)并不高。華東理工大學(xué)和中國 科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所相關(guān)研究人員，通過調(diào)控紅色糖多胞菌中參與紅霉素生物合成的pks后 修飾酶eryk （p450務(wù)基化酶）和eryg （依賴s-腺昔甲硫氨酸的0-甲基轉(zhuǎn)移酶）的生物合成量， 最終實現(xiàn)了紅色糖多胞茵發(fā)酵過程中紅霉素a的產(chǎn)量提升和紅霉素的品質(zhì)提升。螺旋霉素是另一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，雖然其作用機理、抗菌圖譜與紅霉素相類似，但是抗菌效 應(yīng)比紅霉素稍差。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院

10、醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所的相關(guān)研究人員，通過構(gòu)效關(guān)系研究表明， 螺旋霉素分子的碳霉糖部分經(jīng)過4''-?；稍黾臃肿拥闹苄?，因而提高其組織濃度從而增加其 抗菌效應(yīng)。將來自耐熱鏈霉菌碳霉素生物合成基因簇中的編碼異戊?；D(zhuǎn)移酶基因?qū)氩⒄系铰?旋霉素產(chǎn)生菌中，這樣做的目的是為了延伸螺旋霉素合成途徑，最終獲得4-異戊酰螺旋霉素的重 組菌株，并開始產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)得到相應(yīng)的新合成螺旋霉素。中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所周敏教授和他的團隊通過基因敲除，把天 藍色鏈霉菌基因組中的10個聚酮生物合成基因簇、非核糖體多肽生物合成基因簇、線型染色體左 臂的亞端粒區(qū)等1. 2 mb,構(gòu)建

11、出zm11菌株。并且又在新菌株導(dǎo)入了放線紫紅素生物合成基因簇， 通過與野生產(chǎn)放線紫紅素菌株產(chǎn)的放線紫紅素含量相比，該構(gòu)造的菌株產(chǎn)放線紫紅素的量明顯有大 幅度的提升。表明新構(gòu)造的茵株能更好地表達出目標(biāo)產(chǎn)物。目前，國家的多項重大科技計劃和重大新藥創(chuàng)制計劃等幫助了與微生物藥物合成生物學(xué)相關(guān)的 項目和課題，預(yù)計未來我國在微生物制藥合成生物學(xué)將取得更多的成就。（二）國外研究現(xiàn)狀同國內(nèi)的科學(xué)家一樣，國外科學(xué)家對于抗生素的生產(chǎn)研究也是不懈努力著。就對于底盤細胞的設(shè)計和改造而言，國外生物工程學(xué)家對于發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素的工業(yè)微生物菌種阿維鏈霉菌提出了新 的嘗試。2010年komatsu和他的團隊通過比較阿維鏈霉菌

12、、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌這三者的基 因組發(fā)現(xiàn)，這些微生物都有一個大小為6.3mb左右 的保守核心域，于是采用同源重組和位點特異性 重組技術(shù)，敲除類胡蘿卜素等5種次級代謝產(chǎn)物基因簇、還有一部分轉(zhuǎn)座子和多個插入序列，最 終獲得只有17個系列的最小化基因組阿維鏈霉菌。并在3年后，該團隊又順利將核糖霉素、福里 波霉素、抗霉素生物合成基因簇分別導(dǎo)入到之前所得到的新阿維鏈霉素中，結(jié)果是各抗生素產(chǎn)量都 有提升，而阿維菌素的卻沒有檢測到。表明最小基因組阿維鏈霉素的穩(wěn)定和高產(chǎn)性能。對于最小基因組微生物菌株的研究較為成熟的還有天藍色鏈霉菌，天藍色鏈霉菌作為一種模式 微生物在抗生素生產(chǎn)研究中有重大的意義o 201

13、1年gomez-escr i bano和他的同事依次敲除act、red、 cpk、cda生物合成基因簇，最終得到一個細胞生活、代謝通路都正常的最小基因組天藍邑鏈霉菌， 進一步定點突變編碼rnapolb亞基的基因rpob. 和編碼核糖體蛋白s12的基因rpsl,之后再突 變株中分別導(dǎo)入放線紫紅素生物合成基因簇、氯霉素生物合成基因簇，最后不僅降低了代謝產(chǎn)物的 復(fù)雜度，還使得抗生素產(chǎn)量均高于原始菌株。在聚酮類抗生素在大腸桿菌中的高效表達中，底盤細胞大腸桿茵面臨3個無法避免的問題。只 有解決了這3個問題，這類抗生素才能在大腸桿菌中高效表達。這3個問題分別是聚酮合酶在大腸 桿菌中的正確折疊及翻譯后修飾；

14、聚酮化合物的合成前體物質(zhì)供給；聚酮合酶的生物活性和前體供 給的同步。而美國塔夫茨大學(xué)的pfeifer教授和他的研究人員在進行6-脫氧紅霉內(nèi)酯 b(6-deoxyerythronol ide b, 6-deb,紅霉素前體)在大腸桿菌中的異源高效表達過程中恰如其分的 解決了上述3個問題。首先，在大腸桿菌基因組整合了編碼sfp型磷酸泛酰疏基乙胺轉(zhuǎn)移酶基因， 這種轉(zhuǎn)移酶的底物專一性不高，但既可以修飾i型聚酮合成酶的脫輔基acp,又可以修飾ii型聚酮合 成酶的脫輔基acp,所以解決了第一個問題。在上述編碼轉(zhuǎn)移酶基因整合到大腸桿菌基因組的同時， 又刪除刪除了丙酸鹽分解代謝的相關(guān)基因，只保留將丙酸鹽轉(zhuǎn)化為丙

15、酰輔酶a的基因，從而丙酸鹽不 會被分解而是大多數(shù)轉(zhuǎn)化為6-deb的前體丙酰輔酶a,第二個問題解決。6 一脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶 (debs, 一種聚酮合酶)經(jīng)誘導(dǎo)表達，同時外加丙酸鹽，使得該聚酮酶活性和前體物質(zhì)供給得以同 步，繼而第三個問題解決。青蒿酸是青蒿素生物合成的前體物質(zhì)，可通過兩步化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為青蒿素。美國加州大學(xué)的 keasl ing教授通過合成生物學(xué)技術(shù)以酵母菌為宿主細胞，結(jié)合源于細菌、酵母及青蒿等的多種酶及 代謝途徑的組裝和精密調(diào)控，又對青蒿素代謝途徑進行了重新設(shè)計，目的是為了降低天然或非天然 代謝產(chǎn)物對酵母的毒害作用，從而使得微生物生產(chǎn)青蒿酸成為可能，并且提高青蒿酸的產(chǎn)量。伴隨 青

16、篙酸的產(chǎn)量劇增，青篇素的產(chǎn)量也大幅度上升，最終青蒿素的合成能力提高到25 g/lo那時候青 蒿素就從植物細胞次級代謝產(chǎn)物藥物變成了微生物細胞次級代謝產(chǎn)物藥物。在keasl ing教授團隊這 一實驗過程中，他們有些思想值得借鑒，如他們將合成底物的甲程戊酸途徑分成上下兩個模塊進行 分別研究在組合，大大降低了復(fù)雜度和實驗難度；建立了一套研究基因間可調(diào)區(qū)域控制基因表達水 平的方法等。利用keas i i ng教授團隊在生產(chǎn)青蒿素過程中想法，stephanopou i os實驗室開始致力于如何提高 紫杉醇產(chǎn)量的研究。他們將從三磷酸甘油等底物到合成紫杉醇這系列代謝途徑中的第一個中間產(chǎn)物 紫杉烯(taxad

17、iene)的代謝途徑分成2個模塊了，第一個模塊是合成焦磷酸異戊烯酯 (ipp, i sopenteny i pyrophosphate),第二模塊是從焦磷酸異戊烯酯(ipp, i sopenteny i pyrophosphate 就)到紫杉烯(taxadiene)的過程，然后利用多變量研究來協(xié)調(diào)兩模塊之間表達水平，通過協(xié)調(diào)達到限制有毒代謝產(chǎn)物。引。朵的積累的目的，最終將大腸桿菌中紫杉烯產(chǎn)量提高了約15000倍，達到約1 g/l的水平。原來自然界中天然合成的紫杉醇量很少，經(jīng)過合成生物學(xué)的辦法，實現(xiàn)了植物來源的 活性小分子可以由微生物進行表達，并且大大提高了紫杉醇產(chǎn)量。在荷蘭的一家名叫dsm的公司，在這里的相關(guān)研究人員將編碼產(chǎn)黃頭胞霉中的擴環(huán)酶基因和編 碼假單胞菌中的酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氲疆a(chǎn)青霉素的黃青霉中，并且在含有己二酸前體的特定培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，從而實現(xiàn)了黃青霉生物合成己二?；?-氨基-3-去乙酰氧基頭胞烷酸(adipoyi-7-adca); 由于黃青霉中的青霉素發(fā)酵效價高，所以該生物發(fā)酵也同樣可以大量地獲得adipoyl-7-adca (頭胞 菌素化學(xué)半合成前體)；