氨基糖苷耐藥銅綠假單胞菌特異蛋白的研究

1、氨基糖昔耐藥銅綠假單胞菌特異蛋白的研究宋敏丁銀環(huán)向成玉黃麗瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川 瀘州646000【摘要】目的通過篩選氨基糖昔耐藥銅綠假單胞菌的特異蛋白，為研究氨基糖 昔耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 收集木院20年9月2012年6 月臨床分離的82株銅綠假單胞菌，并根據(jù)藥敏情況將菌株分為氨基糖昔耐藥組 和氨基糖昔敏感組。采用seldi-tof ms技術(shù)篩選出兩組的差異蛋白峰，查閱 swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)初步鑒定差異蛋白。結(jié)果共篩選4個(gè)蛋白峰表達(dá)最具差異, 質(zhì)荷比分別為10372.87、9900.02、9101.25、7600.04。結(jié)論 氨基糖背耐藥銅綠 假單胞菌和氨

2、基糖昔敏感銅綠假單胞菌蛋白表達(dá)存在差異，這些蛋白對(duì)氨基糖昔 耐藥機(jī)制的研究具有重要的意義?！娟P(guān)鍵詞】表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；耐藥；銅綠假單胞菌application of spec訐ic proteins for aminoglycoside-resistant pseudomonas aeruginosasong min, ding yin-huan, xiang cheng-yu, huang li,(department of laboratory medicine, the affiliated hospital of luzhou medical college, lu

3、zhou 646000, china)【abstract】objective： to screen specific protein for aminoglycoside-resistant pseudomonas aeruginosa, and lay the foundation for the study of resista nee mechanisms for aminoglycoside-resistant pseudomonas aeruginosa.methods： from september 2011 to june 2012, a total of 82 strains

4、of pseudomonas aeruginosa isolated from clinical specimens were divided into aminoglycoside-resistant group and aminoglycoside-sensitive group based on susceptibility test.different protein peaks were selected by seldi-tof ms technology between the tow groups, and preliminary identificated in swiss-

5、prot protein database.results： four protein peaks which were 9900.02、7600.04、9101.25 and 10372.87 were found expressing sign訐icantly differentially.conclusions： proteins expressed differently between aminoglycoside-resistant group and aminoglycoside-sensitive group.these proteins had im porta nt sig

6、n ificance for the study of amino glycoside resista nee mecha nisms 【keywords surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry tech no logy； re sista nee； pseudom onas aerugi nosa中圖分類號(hào)r977.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a 文章編號(hào)1672-5018 (2016) 01-084-02銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa, pae)是醫(yī)院感染的

7、主要病原 菌之一。近些年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，由銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院感染 比例明顯上升。衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，2011年銅綠假單胞菌臨床分 離率在非發(fā)酵菌中位居第一1。氨基糖昔耐藥銅綠假單胞菌的流行和傳播使銅 綠假單胞菌的控制變得愈加困難。本研究擬從蛋白組學(xué)的角度對(duì)本院臨床分離的 銅綠假單胞菌進(jìn)行氨基糖昔類修飾酶耐藥機(jī)制研究，旨在為臨床合理使用抗菌藥 物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，控制耐藥菌株的流行提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1菌株來源收集我院2011年9月-2012年6月臨床分離出的82株銅綠假單胞菌。1.2菌株的鑒定及藥敏采用microscan walkaway 96si全自動(dòng)

8、微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行菌 株鑒定及藥敏。根據(jù)藥敏情況分為氨基糖昔類抗菌藥物耐藥組：對(duì)阿米卡星、慶 大霉素、妥布霉素3種氨基糖甘類抗菌藥物中至少一種耐藥的菌株；氨基糖卄類 抗菌藥物敏感組：對(duì)以上3種氨基糖昔類抗菌藥物均敏感的菌株。質(zhì)控菌株為 atcc25922大腸桿菌和atcc27853銅綠假單胞。1.3檢測(cè)差異蛋白采用有機(jī)溶劑沉淀法提取細(xì)菌蛋白質(zhì)，將細(xì)菌蛋白提取液與等量的 半飽和芥子酸(sinapinic acid, spa)溶液振蕩混勻后，取2 &micro兒樣品混合液 點(diǎn)加于活化的au芯片芯池中央，室溫干燥后再取1 &micro兒半飽和spa點(diǎn)于芯 池中央，室溫干燥后

9、采用pbs ii/c型蛋白指紋圖譜儀檢測(cè)結(jié)合在au芯片表面的 蛋白。1.4數(shù)據(jù)分析采用biomarker wizard 3.1軟件篩選岀氨基糖昔類耐藥菌株組和氨基糖 昔類敏感菌株組的差異蛋白質(zhì)譜峰，用t檢驗(yàn)比較兩組菌株蛋白質(zhì)峰值的差異, p<0.05的蛋白質(zhì)峰差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在篩選出的差異蛋白峰中兼顧峰高度 較高、p值較小、標(biāo)準(zhǔn)差值較小的原則，選擇最具差異性的蛋白質(zhì)。1.5查閱swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)初步鑒定差異蛋白查閱swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，在分子量(mw)項(xiàng)輸入篩選的最具差異蛋白的相 對(duì)分子質(zhì)量數(shù)值,種類項(xiàng)輸入“pseudomonadales (假單胞菌目)

10、”,質(zhì)量范圍設(shè) 為 0.1 %。2結(jié)果2.1銅綠假單胞菌蛋白指紋圖本研究在質(zhì)荷比2000-10000之間捕獲到4個(gè)最具差異蛋白質(zhì)峰,m/z分 別是 10372.87、9900.02、9101.25、7600.04。其中，m/z 為 10372.87、9101.25、 7600.04的蛋白峰在氨基糖昔耐藥菌株組表達(dá)上調(diào)，m/z為9900.02蛋白峰在氨 基糖昔耐藥菌株組表達(dá)下調(diào)。這4個(gè)蛋白質(zhì)峰差異蛋白峰相對(duì)強(qiáng)度見表1 表1氨基糖卄類耐藥菌株和氨基糖卄類敏感菌株差異蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度(±s)3討論seldi-tof ms質(zhì)譜技術(shù)是基于基質(zhì)輔助激光解吸附及離子化(matrix&

11、;ndash;assisted laserdesorption/ionization, maldi)發(fā)展而來的一種新興 的蛋白組學(xué)技術(shù)。seldi-tof ms技術(shù)的主體是蛋白質(zhì)芯片、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和相 關(guān)數(shù)據(jù)軟件。其基本原理是：通過激光脈沖輻射使結(jié)合在芯片上的分析物發(fā)生離 子化，根據(jù)這些離子質(zhì)荷比不同，在質(zhì)譜儀真空管內(nèi)飛行到離子檢測(cè)器的吋間不 同，由此捕獲并繪制成質(zhì)譜圖，經(jīng)相關(guān)數(shù)據(jù)軟件處理形成模擬圖譜，該圖譜可直 觀顯示捕獲蛋h質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、含量、等電點(diǎn)等信息。seldi-tof ms技術(shù)近 幾年已廣泛應(yīng)用于病原微生物蛋白組學(xué)的研究，并且在病原微生物的鑒定、生物 標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)、致病機(jī)理、

12、耐藥機(jī)制、新型藥物、潛在疫苗的研究上，取得了令 人鼓舞的成果3 刀。通過病原菌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)在抗菌藥物的作用下，病原菌所表 達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)生了何種變化以及如何變化，從而為病原菌耐藥機(jī)制的研究、流行 病學(xué)的調(diào)查提供理論基礎(chǔ)。謝貝等對(duì)比分析單耐利福平(rfp)耐藥分枝桿菌 株與敏感分枝桿菌早、中期培養(yǎng)濾液中差異的蛋白質(zhì)/多肽，發(fā)現(xiàn)早、中期都存 在差異蛋白/多肽，有望從中篩選到rfp耐藥的特異標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)最 具差異的蛋白峰。其中，9900.02在氨基糖井類耐藥菌株的表達(dá)低于氨基糖井類 敏感菌株，對(duì)應(yīng)的蛋白為核糖體蛋白主要調(diào)控細(xì)菌蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯過程。7600.04 在氨基糖昔類耐藥菌株

13、的表達(dá)高于氨基糖昔類敏感菌株，對(duì)應(yīng)蛋白為冷休克蛋白 cspa。冷休克蛋白cspa表達(dá)量增高，菌株對(duì)抗外界環(huán)境的能力強(qiáng)加，不可避免 的增加了細(xì)菌的感染傳播的機(jī)會(huì)。9101.25在氨基糖昔類耐藥菌株的表達(dá)高于氨 基糖昔類敏感菌株，對(duì)應(yīng)蛋白為影響膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白插入效率因子。細(xì)菌膜蛋白 在細(xì)菌耐藥機(jī)制中起著重要的作用，如細(xì)菌外膜蛋白通道缺失、表達(dá)降低都將使 抗菌藥物難以達(dá)到作用靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生耐藥。膜蛋白插入效率因子對(duì)膜蛋白功能 產(chǎn)生何種影響有待進(jìn)一步研究。10372.87在氨基糖昔類耐藥菌株的表達(dá)高于氨基 糖背類敏感菌株，對(duì)應(yīng)的蛋白為調(diào)控細(xì)菌分裂的mine蛋白。mine蛋白包括兩個(gè) 功能結(jié)構(gòu)域：n端的

14、拮抗mincd分裂抑制因子結(jié)構(gòu)域，能夠解除mincd復(fù)合體 與細(xì)胞膜的聚合；c端的拓?fù)鋵Ｒ唤Y(jié)構(gòu)域，能夠識(shí)別存在于細(xì)胞中部和兩極的潛 在分裂位點(diǎn)。氨基糖背類耐藥菌株中高表達(dá)的mine蛋白，可能導(dǎo)致菌株異常分 裂，迫使耐藥菌株難以控制。氨基糖昔類耐藥銅綠假單胞菌的這些差異蛋白，與 氨基糖昔類修飾酶基因的關(guān)系以及與耐藥機(jī)制的明確關(guān)系有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)李耘，呂媛，鄭波衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2011年度非發(fā)酵革蘭陰性桿菌 耐藥監(jiān)測(cè)j中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2012, 28 (12)： 883-887.2 aloush v, navon-venezia s, seigman-lgra y, et al

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