基于主成分研究不同初加工方法大黃蒽醌和酚酸類成分比較探究

1、基于主成分研究不同初加工方法大黃恿醍和酚酸類成分比較探究摘要該實驗?zāi)康氖菍?0種不同初加工方法的 大黃藥材中的恿醍類及酚酸類成分進(jìn)行比較研究，探索大黃 產(chǎn)地加工方法對成分的影響。利用hplc同時測定蘆薈大黃 素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲瞇、沒食子酸、兒 茶素7個主要成分含量，利用紫外分光光度法測定了總酚酸 含量。采用spss軟件進(jìn)行了主成分分析，利用主成分得分 進(jìn)行大黃評分評級。不同的初加工方法大黃藥材總蔥醍類成 分含量變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，大黃釆收后是否趁鮮切制以 及如何干燥，直接影響其有效成分蔥醍及酚酸的含量。結(jié)果 表明奉節(jié)產(chǎn)大黃烘干大塊干貨評分最高，支根總蔥醍和酚酸 均比主根含量

2、高，水潤過程產(chǎn)生提高;t醍類物質(zhì)含量及降低 酚酸類物質(zhì)含量作用。關(guān)鍵詞大黃；主成分分析；初加工；恿醍；酚酸； hplc；含量測定收稿日期2013-10-16基金項目重慶高等職業(yè)技術(shù)院校應(yīng)用技術(shù)推廣中心 新技術(shù)推廣項目通信作者*高文遠(yuǎn)，tel: (022) 87401895, e-mail：pharmgaotju. edu. cn作者簡介付紹智，e-mail： fushaozhisina. com大黃享有我國傳統(tǒng)中藥“四大金剛”之一的美譽，是我 國四大最常用的中藥之一。重慶三峽地區(qū)奉節(jié)及毗鄰的湖北 利川是大黃的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，植物來源為藥用大黃rheum officinale bail.,商品上習(xí)

3、稱"馬蹄大黃”。 大黃的傳 統(tǒng)加工方法主要有熏干法、烘干、陰干2等，其產(chǎn)地加工 無技術(shù)指南，存在一定的盲目性和隨意性。2010年版中國 藥典一部大黃項下也只是簡單闡述大黃采挖后如何加工， 沒有其產(chǎn)地加工品及質(zhì)量的相關(guān)記載。大黃采收后是否趁鮮 切制以及如何干燥，直接影響其主要藥效成分蔥醞類及酚酸 物質(zhì)的含量3-4 o游離蔥醍類成分為大黃的主要藥效成分 之一 5,本文以蔥醍類和酚酸類成分含量為評價標(biāo)準(zhǔn)，利 用hplc直接測定不同初加工方法對大黃中5種蔥醍類和2 種酚酸成分含量的影響，探討了蔥醍類和酚酸類成分在大黃 初加工過程中的變化規(guī)律，為大黃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂及其 產(chǎn)地初加工技術(shù)改進(jìn)提

4、供依據(jù)。1材料waters 1525-2998高效液相色譜系統(tǒng),安捷倫hp 1100 色譜儀，g1311a四元泵，hprev. a. 0501化學(xué)工作站；cp225d 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；kh-250b型 超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;wnd-200型高速 中藥粉碎機（浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司）。大黃素購自中國食品藥品檢定研究院（批號 110756-200100）；蘆薈大黃素（純度98%）,大黃酸（純度 98%）,大黃酚（純度98%）,大黃素甲瞇（純度98%）,兒茶 素（純度98%）,沒食子酸（純度98%）均購自金測分析技術(shù) 有限公司（天津）；濃鹽酸，磷

5、酸，三氯甲烷，無水碳酸鈉 均購自天津江天化工有限公司；福林酚試劑購自天津市光復(fù) 科技發(fā)展有限公司；純凈水購自娃哈哈集團(tuán)公司；色譜純甲 醇購于康科德科技有限公司。大黃藥材采自重慶奉節(jié)云霧鄉(xiāng)及毗鄰的湖北利川元堡 鎮(zhèn)，原植物及藥材經(jīng)天津大學(xué)高文遠(yuǎn)教授鑒定為藥用大黃 rh. officinale bail.,共10批,初加工方法見表1。2方法與結(jié)果2. 1 色譜條件 kromas訂 c18 色譜柱（4. 6 mmx250 mm, 5 urn）, 5種;t醍類物質(zhì)以甲醇-0. 1%磷酸溶液（85 : 15）為 流動相；檢測波長254 nm。兒茶素和沒食子酸的流動相為乙 月青（a） -0. 5%冰醋酸（b

6、）, 05 min, 2% a； 25 min, 8%a； 45 min, 12%a； 50 min, 80%a； 55 min, 2%a。檢測波長 280 nm,理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于3 000o色譜圖見圖 1, 2o表1不同大黃樣品的產(chǎn)地及加工方法table 1 producing areas and initial processing method of different processed products from rheumofficinale注：批號相同代表同一株大黃，批號不同代表不同株。1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚； 5.大黃素甲瞇。圖1大黃對

7、照品(a)及樣品(b)的蔥醍成分hplc圖fig 1 hplc chromatograms of anthraquinones constituents of the standard mixture solution (a) and samples (b)1.沒食子酸；2.兒茶素。圖2大黃對照品(a)及樣品(b)酚酸成分的hplc圖fig.2 hplc chromatograms of phenolic acids of the standard mixture solution (a) and samples (b)2.2蔥醍類對照品制備精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、 大黃素、大黃酚、大黃素

8、甲瞇對照品適量，加甲醇分別制成 每1譏含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 ug, 含大黃素甲醞10 ug的甲醇溶液。2.3酚酸類成分對照品制備 精密稱取沒食子酸與兒茶 素對照品適量，配置成含沒食子酸0. 341 3 gml-1與兒茶 素為0. 336 0 gml-1的甲醇溶液。2.4蔥醍類成分供試品的制備 取本品粉末0.15 g it 4 號篩，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25 ml, 稱定質(zhì)量，加熱回流1 h,放冷至室溫。再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 ml,置 燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml,超聲處理2 min, 再加三氯甲烷1

9、0 ml,加熱回流1 h,放冷至室溫。置分液 漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并加入分液漏斗中，分 取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml, 合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干。殘渣加甲醇使溶解， 轉(zhuǎn)移至10 inl量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾 液即得。2.5酚酸類成分測定供試品的制備精密稱取大黃藥材粉末0.5 git 4號篩，置具塞錐形瓶中，精密加 入20%甲醇溶液25 ml,稱定質(zhì)量，超聲處理40 min (120w, 50 hz),再稱定質(zhì)量，用20%甲醇溶液補足減失質(zhì)量，搖勻, 濾過，取續(xù)濾液，即得。2.6總酚酸線性關(guān)系考察分別精密吸取上述對照品溶 液 0.

10、0, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6 ml 于 20 ml 試管 中。分別加入蒸%留水 6, 5. 9, 5. 8, 5. 7, 5. 6, 5. 5, 5. 4 ml, 分別加入福林試劑1. 0 ml,充分振蕩后靜置34 min,以 及10% na2c03溶液1. 0 ml,搖勻置于25 °c恒溫水浴中反 應(yīng)2 h后于765 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得沒 食子酸回歸方程為y = 0. 012x-0. 036 8 (r2= 0. 999 5),線 性范圍20100 ugo2.7單體類成分線性關(guān)系考察上述5種對照品分別逐 級稀釋，依次稀釋

11、到原來濃度的1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 依法測定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(nigl-1)為橫坐標(biāo)，峰面積 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。在實驗條件下對 上述混合對照品溶液進(jìn)行分析，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面 積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程分 別為蘆薈大黃素y二22 504x+3 210.4 (r2=0. 999 4),大黃酸 y=8 978. 3x+669. 88(r2=0. 999 1),大黃素 y=30 447x+2 620. 1(r2=0. 999 2),大黃酚 y二49 466x-3 932 (r2=0. 999 8), 大黃素甲瞇 y=15

12、 475x-250. 54 (r2=0. 999 2)。結(jié)果表明， 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚種對照品分別在0. 005 00.160 0 ng線性關(guān)系良好，大黃素甲瞇在0.003 1 0. 100 0 pg線性關(guān)系良好。沒食子酸y二26 043x-1.076 6(r2二0. 999 9),兒茶素 y二 6 600. 6x-18. 728 (r2=0. 999 7), 兒茶素在0. 105 03.360 7 u g線性關(guān)系良好，沒食子酸 在0. 107 33.413 1 ug線性關(guān)系良好。2.8精密度試驗精密吸取上述供試品溶液10 ul,重 復(fù)進(jìn)樣6次，依法測定，結(jié)果各對照品峰面積積分

13、值的rsd 均小于1. 5%o2. 9穩(wěn)定性試驗精密吸取上述供試液溶液10 ul,間 隔一定時間進(jìn)樣共6次，各對照品峰面積積分值的rsd均小 于1.4%,可見樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。2. 10重復(fù)性試驗 取大黃生片粉末6份，各約0.15 g, 精密稱定，制備成供試品溶液，依法測定并計算含量，結(jié)果 各對照品6次測定值的rsd分別為1.0%, 0.56%, 0. 43%,0.48%, 0. 78%, 1.0%, 1.2%o2. 11加樣回收率試驗精密稱定已知含量的大黃生片 粉末0. 15g,共6份，分別精密加入各對照品適量，按供試 品溶液制備及測定法操作，進(jìn)行色譜分析。蘆薈大黃素、大 黃酸、

14、大黃素、大黃酚、大黃素甲瞇、沒食子酸、兒茶素的 加樣回收率分別為 98. 99%, 98. 30%, 98. 90%, 98. 55%, 98. 90%, 98.12%, 9& 31%； rsd 分別為 1. 0%, 0.56%, 0.43%, 0.48%, 0. 78%, 1. 0%, 1.2%o2. 12樣品含量測定按2.6, 2.7項下方法操作，平行 測定3份，于765 nm處測定吸光度，將所得平均吸光度帶 入回歸方程，計算各個品種大黃樣品中總酚酸含量；7種單 體類成分進(jìn)樣10 ul進(jìn)行hplc分析。不同初加工方法大黃 蔥釀含量測定結(jié)果見表2。表2不同初加工方法大黃恿醍及酚酸類成

15、分含量測定table 2 contents of anthraquinones and phenolic acids in different processed products from rheum officinale bailg g-1注：字母表示各樣本間組間差異，相同字母表示2組數(shù) 據(jù)不存在顯著性差異（p將不同大黃成分含量標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)與相應(yīng)主成分得分系數(shù)的乘積相加得到大黃蔥醍和酚 酸含量的主成分得分。主成分得分可以反映加工方法對大黃 質(zhì)量的影響，得分越高代表主要成分含量越高，即大黃質(zhì)量 越好。從圖中總得分排序結(jié)果可以看出，奉節(jié)產(chǎn)烘干大塊干 貨大黃評分最高質(zhì)量最好，5, 6號樣品僅次于8

16、號，即利川 產(chǎn)大黃質(zhì)量均較優(yōu)，且烘炕加工方法稍優(yōu)于煙熏處理的大黃 質(zhì)量。主根-鮮切段-干燥-水潤-切片-干燥所得評分最低， 主根-鮮切段-干燥其次，圖3可看出主根的蘆薈大黃素、大 黃素、大黃酚及酚酸類物質(zhì)含量均低于支根。因子載荷散點圖和主成分分析圖見圖4, 5o結(jié)果顯示， 大塊干貨-潤透-切片-干燥的處理方法得到的大黃具有較高 含量的蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚類成分，但此加工方法 對酚酸類成分卻產(chǎn)生了降低的作用?？傮w看來利川產(chǎn)大黃具 有較高含量的蔥釀和酚酸類成分。圖4不同成分的因子載荷散點圖fig. 4 loadings plot of pca of different constituent

17、s圖5 10批大黃樣品的主成分分析得分圖fig. 5 scores his to gram of pca 10 bat ches of rheum officinale bail3結(jié)論本研究中以hplc測定了大黃不同初加工方法藥材中蘆 薈大黃素等5種蔥醍昔元、2種酚酸類單體成分及總酚酸含 量，通過對大黃不同初加工方法的10批次不同藥材的含量 測定，并以平均含量進(jìn)行比較，對結(jié)果進(jìn)行了主成分分析， 藥材中5種蔥醍類和2種酚酸類成分的含量呈現(xiàn)一定的變化 規(guī)律。利用主成分分析有效地揭示大黃各成分含量與大黃質(zhì) 量的關(guān)系。分析結(jié)果基本上反映了不同加工方法對大黃蔥醍 含量和酚酸含量的貢獻(xiàn)率，可以看出奉節(jié)產(chǎn)烘

18、炕，大塊干貨 處理得到的大黃具有較高的蔥釀類含量和酚酸類成分含量。 總體上烘干方法優(yōu)于煙熏處理。從各成分含量結(jié)果分析可見，不同的初加工方法對大黃 藥材質(zhì)量的影響很大，大黃采收后是否趁鮮切制以及如何干 燥，切片還是切塊都直接影響其有效成分蔥醍的含量。就5 種蔥醍物質(zhì)總含量來說，14號樣品來自同一株大黃，1, 3 樣品比對應(yīng)2, 4號樣品總恵醍含量低，此結(jié)果說明“鮮大 黃先切斷塊-干燥后-再潤-再切片-干燥”的加工方法比 “鮮大黃直接切片-干燥”的加工方法所含總恿醍含量高， 同時說明了 “鮮大黃先切斷塊-干燥后-再潤-再切片-干燥 的”的加工程序?qū)偅货慨a(chǎn)生了一個提高的作用，但對 酚酸類成分（

19、兒茶素、沒食子酸）產(chǎn)生了降低的作用，此結(jié) 果在圖3中也可得出，造成此影響可能是由于水潤過程而產(chǎn) 生，所以以減少工序和人工用量的鮮切片集中加工方法還有 待進(jìn)一步研究。此外，支根在大黃的產(chǎn)地加工中常作為丟棄 的部分，造成了嚴(yán)重的浪費。由本實驗結(jié)果可以得出結(jié)論， 在產(chǎn)地初加工過程中大黃支根不僅不應(yīng)該丟棄，且應(yīng)該作為 優(yōu)質(zhì)原料進(jìn)行加工利用。具有較高評分的5, 6, 8號樣品的6, 8號樣品均采用 烘干方法，結(jié)果初步推測烘干大塊干貨較優(yōu)于煙熏方法，大 塊干貨較切片方法質(zhì)量更好，且省時省力，此加工方法有望 在產(chǎn)地集中建立初加工廠中推廣使用，具體優(yōu)化方法有待于 進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) 中國藥典.一部s. 20

20、10： 22.2張村，李麗，肖永慶，等大黃5種藥材中游離蔥 醍類成分比較研究j.中國中藥雜志,2009,34(15)： 1914.3李蕓，苗小樓，吳平安，等不同產(chǎn)地加工方法對 掌葉大黃藥材質(zhì)量的影響j.中藥材，2011, 34 (8)： 1196.4李蕓，苗小樓，吳平安，等.大黃不同品種不同產(chǎn) 地加工品的恿醍含量比較j.藥物分析雜志，2012, 32(12)： 2257.5吳永江，陳建軍，程翼宇.rp-hplc同時測定苦黃 注射液中4種大黃蔥醍類成分含量j.中國中藥雜志， 2004, 29 (11)： 1041.comparision of contents of anthraquinones

21、 and phenolic acids compoundsin different processed products from rheumofficinaleby principal component analysisfu shao-zhi, wang ting-ting, gao wen-yuan, li xia(1.chongqing three gorges medical college , chongqing 404120, china；2. school of pharmaceutical science and technology, tianjin university,

22、 tianjin 300072, china)abstract the aim of this study is to compare the contents of five types of anthraquinones which mainly in eludes chrysopha nol, physci on, emodin, rhein and physcion and phenolic acids in ten different processed products from rheum officinale, and to investigate the effect of different initial processing method on the contents of anthraquinones and phenolic acids. principal comp orient analysis (pca) was carried out by spss software to evaluate the quality of different processed products from rh. offici nale in con elusion,