南方紅豆杉水提物抑制裸鼠A549肺癌移植瘤生長和其機制探究

1、南方紅豆杉水提物抑制裸鼠a549肺癌移植瘤生長和其機制探究摘要目的：研究南方紅豆杉水提物對裸鼠a549 肺癌移植瘤生長的抑制作用和機制。方法：建立荷a549肺 癌移植瘤模型，隨機分為對照組、低、中、高劑量南方紅豆 杉水提物實驗組，24h后以等體積生理鹽水及藥物灌胃，給 藥7周，每3d測移植瘤長短徑，繪制移植瘤生長曲線，給 藥7周后處死裸鼠，取瘤組織，計算抑瘤率，采用real-time pcr及western blot方法檢測mrna和蛋白水平。結果：南 方紅豆杉水提物各劑量組均有明顯抑瘤效果（p 2.4 real-time pcr檢測mrna水平 取50100 mg移植瘤組織， trizol法

2、提取總rna, nanodrop 2000分光光度計測定rna 濃度，確定rna的純度及濃度，a260/a280在1. 82. 0。按 試劑盒說明進行pcr逆轉錄后，熒光定量pcr儀進行擴增。 以管家基因gapdh為內參基因，設計引物如下：survivin上 游引物 5 -ctaccgagaacgagcctgatt-37,下游引物5 -agccttccaattccttaaagcag-37 ,擴增產(chǎn)物長度 60 bp； vegf 上游引物 5 -tttggcaaatacaacccttcaga-3z，下游引 物 5 -gcagaagatactgtcaccacc-37，擴增產(chǎn)物長度 133 bp；

3、egfr±游引物 5 -atgaaaacacctatgccttagcc-3'，下游引 物 5 -taagttccgcatgggcagttc-3',擴增產(chǎn)物長度 83 bp； gapdh 上游引物 5 -aggtcggtgtgaacggatttg-37 ,下游引 物 5 -tgtagaccatgtagttgaggtca-3;,擴增產(chǎn)物長度 123 bpo反應條件：95 °c 3 min, 1個循環(huán)進行預變性，95 °c 5 s, 60 °c 1 min,循環(huán)40次。熔解曲線分析：95 °c 15 s, 20 °c si；

4、 60 °c 15 s, 20 °c si； 95 °c 15 s, 0. 1 °c slo 熒光定量結果采用2- a a ct方法分析，統(tǒng)計相對表達量rq (relative quantifiedtion)值。2. 5 western blot檢測蛋白表達 取液氮保存的腫瘤組 織，生理鹽水沖洗，切取重約20 mg小塊，加入含有蛋白酶 抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的裂解液，碎冰上高速機械勻 漿器12 000 rmini破碎組織，提取蛋白。bca法測定蛋白 濃度，等量上樣，10%sds-page電泳，轉至pvdf膜，5%脫脂 奶粉室溫封閉1 h, 一抗(1

5、: 1 000) 4 °c搖床孵育過夜， tbst洗膜10 minx3次，二抗(1 : 3 000)室溫搖床孵育1 h, tbst洗膜10 minx3次，ecl顯色后化學發(fā)光成像系統(tǒng) 成像。以quatity one圖像分析軟件進行積分吸光度值分析。2.6統(tǒng)計學方法用spss 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。 計量資料數(shù)據(jù)用土s表示，各組間差別選用單因素方差分析, p本實驗研究結果表明，南方紅豆杉水提物干預荷肺癌a549移植瘤裸鼠后，對比對照組，各實驗組移植瘤組織 中vegf mrna表達無明顯影響，vegf蛋白表達有下降趨勢， 但無統(tǒng)計學意義，提示南方紅豆杉水提物可能對肺癌a549 移

6、植瘤的血管生成無明顯影響。survivin 是凋亡抑制蛋白家族 (inhibitorofapoptosis, iap)的新成員，是目前發(fā)現(xiàn)最 強的凋亡抑制因子，其功能復雜，具有抑制細胞凋亡，促進 細胞轉化并參與細胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細胞耐 藥性的產(chǎn)生等作用8-9 o survivin具有腫瘤特異性，幾乎 表達于所有的惡性腫瘤，但在人體正常終末分化的組織細胞 中不表達或低表達，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密 切相關。肺癌患者血清中，同樣可以檢測出survivin抗體。 survivin因其獨特的生物學特性有望成為肺癌治療的新靶 點。本實驗研究表明，南方紅豆杉水提物干預荷肺癌a549

7、 移植瘤裸鼠后，對比對照組，各實驗組移植瘤組織中 survivin mrna及蛋白表達水平均明顯下降，且具有統(tǒng)計學 意義，這與體外實驗結果一致10,提示抑制survivin表 達有可能是南方紅豆杉水提物體內抗腫瘤機制之一。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, egfr)是一種相對分子質量為170 kd的跨膜糖 蛋白，配體通過與egfr相互作用，激活下游ras/mapk系統(tǒng)、 pi3k/akt系統(tǒng)、plc/pkc系統(tǒng)，從而將有絲分裂信號向下傳 遞，調控細胞周期，調節(jié)細胞增生、存活、黏附，促進損傷 修復11。此外，egfr信號通路激活后可促進細胞的增

8、殖、 轉移、浸潤、血管生成以及阻斷細胞調亡。惡性組織中egfr 的表達水平高于正常組織，在40%80%非小細胞肺癌患者中 egfr呈過度表達。因此，阻斷或者削弱egfr信號通路是治 療非小細胞肺癌的一條有效途徑。本實驗研究結果表明，南方紅豆杉水提物干預荷肺癌 a549移植瘤裸鼠后，對比對照組，各實驗組移植瘤組織中 egfr mrna 水平明顯降低(p9 pal s k, pegram m.epidermal growth factor receptor and signal transduction :potential targets for anti-cancertherapyj anti

9、cancer drugs, 2005, 16 (5)： 483._10 zhang x, zhang h, tighiouart m, et al. synergistic inhibition of head and neck tumor growth by green tea (-) -epigallocatechin-3-gallate and egfr tyrosine kinase inhibitorj. int j cancer, 2008, 123 (5)： 1005.11張文穎，張為民，王林，等.多西他賽與吉非替 尼序貫應用對人肺腺癌細胞spc-a1生長及信號蛋白的影響 j1i

10、 中國肺癌雜志，2011, 14 (5)： 385.study on inhibitory effect of aqueous extract of taxus chinensis var mairei ongrowth of a549 lung cancer xenografts in nude miceand its mechanismcui qing-lil, 3, shao mei2, 3, shu qi-jin3*(1. oncology hospital affiliated to zhengzhou university, henna provincial oncology ho

11、spital,zhengzhou 450008, china； 2. no. 81 hospital of pla, nanjing 210002, china；3. first hospital affiliated to zhejiang chinese medical university, zhejiang provincial hospital oftraditional chinese medicine, hangzhou 310006, china)abstract objective： to study the effect of aqueous extract of taxu

12、s chinensis var. mairei (aetc) on the growth of a549 lung cancer xenografts in nude mice and its mechanism method： the a549 lung cancer xenograft model was established, and then randomly divided into the control group, and low, middle and high dose aetc experiment groups after 24 hours, they were orally administered with normal saline and drugs of the same volume for seven weeks the length and width of the xenografts were measured every three days, and the xenogra ft grow th curve was draw n. the nude mice were sacrificed after the administration for seven weeks, and their xenograf