菌種保存和微生物常識

1、菌種保存和微生物常識1、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒營養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動所必需的能量和物質(zhì)，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活 動的物質(zhì)基礎，是生命活動的起點。營養(yǎng)物：具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包插光能。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和u好的生理環(huán) 境。營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求：應具備6人營養(yǎng)要素；物質(zhì) 比例合適；必須滅菌。2、選用和設計培養(yǎng)基的原則、方法及制備過程原則：目的明確、營養(yǎng)悔調(diào)、經(jīng)濟節(jié)約物理化學條件適宜方法：生態(tài)模擬、查閱文獻精心設計、試驗比較步驟：稱量、熔化、調(diào)ph、過

2、濾、分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查培養(yǎng)基種類：一、按成分的不同分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基三、按培養(yǎng)基用途基礎培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)棊、加富培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基消毒與滅菌：消毒：消滅病原菌和冇害微生物的營養(yǎng)體滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和泡子。方法：一、物理的方法：加熱、過濾、仙射二、化學的方法：用化學試劑抑制或殺火微生物。主耍破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，堿胺類藥物及 抗生素等。加熱法：（1）干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如銀子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅

3、菌利用高溫干燥空氣（160-1700加熱滅菌12h,適用于玻璃器j【il和培養(yǎng)川l等。原理加熱 使蛋h質(zhì)變性，與水的含量有關，當環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。3、注意事項：1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；2）溫度控制在180°；3）物品不能太擠；4）溫度降至70。時才開箱門。（2）濕熱法：原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低； 濕熱的蒸氣冇潛熱存在。所以效呆比同溫度下干熱好。高壓蒸汽滅菌法：1、設備：高壓滅菌鍋2、時間長短根據(jù)火菌物品的種類和數(shù)量不同冇所變化。3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用丁玻璃器皿的滅菌。4、

4、注意事項:1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時方可打開。常床蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等對采用此法。 徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10-15min,超高溫殺#l：135-150°c和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品。優(yōu)點：保持食品價值和營養(yǎng)成分。過濾除菌：原理：介質(zhì)在冇壓力時阻隔微生物。適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。設備：蔡氏過濾器，濾牘過濾器。優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。需大量無菌空氣以及凈化工作臺。注意爭項：1、壓力適當；2、無蘭條件下進行；3、防止

5、滲透現(xiàn)彖。輻射滅菌:原理：紫外線波長在200-300nm,具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氧。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。缺點：穿透力不大。距照射物v 1.2m為宜。應用：無菌室，醫(yī)院。注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。射線滅菌：r射線，穿透力強，適用于堆積物品的火菌?；瘜W藥品滅菌：原理：應用化學制劑破壞細菌代謝機能。殺菌劑如重金屈離子；抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生索。注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境冇關。常用化學殺菌劑冇：乙醇、醋酸、石碳酸福爾馬林、升汞、高猛酸鉀、新潔爾滅等3、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技

6、術分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。為什么要進行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法稀釋涂布平板法稀釋混合平板法 平板劃線法稀釋涂布平板法：步驟：1、倒平板：牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基,高氏i號培養(yǎng)基,查氏培養(yǎng)棊冷卻至55-60°c時,混勻后倒平板，牛 肉膏蛋口陳培養(yǎng)基倒4 jill，高氏i號培養(yǎng)基和査氏培養(yǎng)基各倒3 jiilo2、制備污水稀釋液：10g 土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml加入盛冇4.5ml 無菌水的試管屮，以此類推，制成不同稀釋度。3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底

7、而標記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即104 10-5 和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。4、培養(yǎng)：高氏i號和查氏倒置培養(yǎng)于28c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days,牛肉育蛋5凍瓊脂培養(yǎng)基在37c培 養(yǎng)1-2dayso5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢査是否一致，保存。平板劃線法：1、倒平板，標記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。2. 劃線方法稀釋混合平板法：1、先加菌2、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度3、混合均勻4、微生物培養(yǎng)技術1、斜面接種2、液體培養(yǎng)基接種3、穿刺接種4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5、將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4°c冰箱中保存。幾

8、種常用的保藏方法：1、傳代培養(yǎng)法保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細菌）培養(yǎng)好后，置4c°冰箱中存放，定期進 行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保期。2、載體法使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、獲皮、磁珠和濾紙片等。3、懸液法將細菌、酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保溶液包括蒸館水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。4、冷凍法使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法利液氮法。此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和l

9、- t燥法。冷凍真空干燥法是將耍保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預凍，然片在低溫狀態(tài)卜進行減壓干燥。l-干燥法則不需要低溫預凍樣品，只是使樣品維持在10-20c*范圍內(nèi)進行真空干燥。操作方法1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜而培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠 塞效果更好)，置4c冰箱中包藏。保藏時間依微生物的種類而定。焉菌、放線菌及芽砲菌保存2-4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月, 普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。2、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔

10、絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實用且效果較好。葆菌、放線菌、芽砲菌町保藏兩年以上，酵母菌可保藏1-2年，普通細菌也 可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后川膠塞封嚴，宜4°c冰箱存放。4、砂土管保藏法(1) 河砂處理取河砂若干加入鹽酸10% ,加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性， 最后-次用蒸錦水沖洗，烘下后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。(2) 土壤處理収菲耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后廡碎，用100 目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。(3) 砂土混合處理妥當?shù)暮由芭c土壤按3：

11、1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后， 裝入10x100mm的小試管或安瓶管屮，毎管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3 次)，最后烘干。(4) 無菌檢查每10支砂土管隨機抽1支,將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30°c培養(yǎng)40h,若發(fā)現(xiàn)有微生物生長,所有 砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用。(5) 菌懸液的制備収生長健壯的新鮮斜面菌種，加入23ml無菌水(每18x180mm的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將 菌苔洗下，制成菌懸液。(6) 分裝樣品每支砂土管(注明標記后)加入0. 5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)，用接種針拌勻。(7) 干燥將裝冇菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也町 用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。(8) 保存置4°c冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多川于產(chǎn)芽抱的細菌、產(chǎn)生砲子的霉菌和 放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛、效果較好，可保存兒年時間，但對營養(yǎng)細胞效杲不佳。5、冷凍真空干燥法(1) 凍干管的準備：中性硬制玻璃,烘干,滅菌。(2) 菌種培養(yǎng)：細