表沒食子兒茶素沒食子酸酯調(diào)控自噬抗心肌缺血再灌注損傷的作用

1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯調(diào)控自噬抗心肌缺血再灌注損傷李春鳳，孫瑤，簡潔*（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004）摘要 目的研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）調(diào)控自噬抗心肌缺血再灌注損傷的作用。方法56只SD大鼠隨機分為假手術(shù)、模型、自噬阻斷劑（3-MA）、EGCG四組（n=8），采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備大鼠心肌缺血再灌注模型，按試劑盒說明書檢測缺血30min.及缺血/再灌注1h.各組肌酸激酶同工酶（CK-MB）、總抗氧化力（T-AOC）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的含量，以Western-blot法檢測心肌微管相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白-（LC3-）、Beclin-1、雷帕霉素靶蛋白（ma

2、mmalian target of rapamycin, mTOR）的表達(dá)。結(jié)果再灌注1h.時自噬的發(fā)生比缺血期顯著；與模型組相比，EGCG能有效提高T-AOC，降低CK-MB及iNOS的含量，下調(diào)LC3-、Beclin-1蛋白表達(dá)，上調(diào)mTOR蛋白表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論自噬在缺血期即發(fā)生并隨著缺血/再灌注時間延長而進一步加強；EGCG預(yù)處理可抑制心肌缺血及再灌注時段自噬的發(fā)生，進而增加心肌抗氧化力，減輕心肌缺血再灌注損傷。關(guān)鍵字 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；心肌缺血再灌注損傷；自噬Effects of epigallocatechingallate on adjusting auto

3、phagy in myocardial ischemia reperfusion injuryLI Chun-feng, SUN Yao,JIAN Jie*（Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541004）ABSTRACT Objective: To study the effects of EGCG onadjusting autophagyin myocardial 基金項目2011年廣西高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助項目（桂教人201140號）第一作者 李春鳳，女，碩士學(xué)位，副教授，從事藥物臨床研究，TelE-mail

4、：1312843592.通訊作者*簡潔，女，博士學(xué)位，教授，從事天然藥物成分分離及心血管藥理研究，TelE-mail:jianjielucky.ischemia reperfusioninjury. Methods: 56 SD rats were randomly divided into control, model, 3MAand EGCG group (n=8). 30min. of ischemia or ischemia/reperfusion 1h, while myocardial ischemia reperfusion model was est

5、ablished by ligating left anterior descending coronary artery.To content of CK-MB, T-AOC and iNOS in serum was determined according to the kit. The protein expression ofLC3-, Beclin-1 and mTORwas observed by western-blot.Results:Autophagy in myocardial ischemia reperfusion1h. was more serious than t

6、hat in the ischemia period.Compared with the model group,EGCG could effectively improveT-AOC, decrease CK-MB and iNOS (P<0.05). Meanwhile, EGCG down-regulated the protein expression ofLC3-and Beclin-1, as well as up-regulated mTOR protein expression (P<0.05).Conclusion: Autophagy occurs in isc

7、hemia then enhances during ischemia/reperfusion period.EGCG preconditioning inhibitsautophagyin myocardial ischemia and reperfusionperiod, further increases myocardial antioxidant capacity and reduces myocardial ischemia reperfusion injury.KEY WORDSEGCG, myocardial ischemia reperfusion injury,autoph

8、agy自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的基本生命現(xiàn)象，其亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程。心肌營養(yǎng)缺乏、缺血/再灌注損傷、心肌細(xì)胞肥大等均可誘發(fā)自噬1。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）是從綠茶中提取的含量最高的兒茶素單體，植物來源豐富。以往對EGCG的研究主要集中在抗氧化、抗炎、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性方面2，近年有文獻(xiàn)3表明EGCG對缺血再灌注損傷心肌有保護作用，但EGCG對自噬的影響未見報道。本研究建立大鼠心肌缺血及缺血/再灌注模型，研究EGCG調(diào)控自噬抗心肌缺血再灌注損傷的作用。1 材料1.1實驗動物SPF級S

9、D大鼠，雌雄不拘，250-280g，購于桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（生產(chǎn)許可證：SCXK桂2009-0002）。1.2藥物與試劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度>95%，大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號：20111209），用生理鹽水溶解備用；自噬阻斷劑3-Methyladenine（3-MA，美國Cayman公司，貨號：13242）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、總抗氧化力（T-AOC）、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；LC3-抗體（美國Epitomics公司，貨號：ab52768）；mTOR、Beclin-1抗體均購于美國CST公司。1.3實驗儀器BL-4

10、20F生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；小動物呼吸機DW-3000（上海嘉鵬科技有限公司）；Model1450型自動酶標(biāo)儀（美國BIORAD公司）；冷凍離心機MikRro220R（美國Beckman公司）；JY300C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；培清JS-780全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。2方法2.1動物分組造模及給藥將56只SD大鼠隨機分為假手術(shù)、模型、EGCG（20mg/kg）、3-MA（15mg/kg）四組（n=8），各組于造模前20min.舌下靜脈給藥（假手術(shù)組及模型組給予同體積生理鹽水），按文獻(xiàn)方法4建立心肌缺血（缺血30min.）及缺血/再灌注

11、損傷（缺血30min.再灌注1h.）模型。2.2指標(biāo)檢測及測定方法2.2.1血清T-AOC、iNOS及CK-MB含量測定造模結(jié)束，腹主動脈取血5ml，離心10min (3000pr·min-1)，吸取上清，按試劑盒說明書檢測血清T-AOC、iNOS、CK-MB含量。2.2.2 Western-blot檢測LC3-、Beclin-1、mTOR的蛋白表達(dá)取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分洗凈殘血，取部分結(jié)扎線以下左心室組織，濾紙吸干、剪碎、液氮研磨，用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白定量，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜橫流90mA，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗4過夜，二抗室溫孵育1h，ECL發(fā)光，

12、X光片顯影、定影后用SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)測其灰度值。2.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1心電圖結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，導(dǎo)致大鼠心電圖ST段明顯抬高，說明造模成功，應(yīng)用EGCG后ST段有所下降，說明EGCG對心肌有保護作用，見圖1。Before ligationAfter ligationIv. EGCG圖1 大鼠心電圖變化3.2血清生化指標(biāo)檢測從表1可見，模型組大鼠T-AOC明顯降低，iNOS及CK-MB顯著升高（P<0.05

13、vs. Sham）；與模型組相比，EGCG能改善心肌缺血及缺血/再灌注大鼠總抗氧化力，減少血清iNOS及CK-MB含量，其保護作用強于3-MA（P<0.05或P<0.01）。表1 缺血30min.及缺血/再灌注1h.大鼠血清iNOS、T-AOC及CK-MB含量(±s，n=8)GroupDose(mg/kg)iNOS(U/ml)T-AOC(U/ml)CK-MB(U/L)Ischemia30min.I/R 1h.Ischemia30min.I/R 1h.Ischemia 30min.I/R 1h.Sham/8.07±0.36*8.07±0.36*13.23

14、±0.80*13.23±0.80*21.18±3.38*21.18±3.38*Model/13.14±0.3016.09±0.477.64±0.937.51±0.75176.04±9.91225.87±22.373-MA1511.57±1.27*13.38±0.68*8.72±0.53*8.89±0.79*152.31±7.46*172.46±15.17*EGCG208.43±1.21*9.54±1.13*12.12

15、±1.46*12.18±1.51*73.33±11.33*84.87±8.04*P<0.05, *P<0.01 vs.Model3.3心肌組織LC3-、Beclin-1、mTOR蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織LC3-、Beclin-1蛋白表達(dá)量顯著增加，mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組相比，EGCG可明顯降低LC3-、Beclin-1蛋白表達(dá)量，提高mTOR蛋白的表達(dá)，其作用效果比3-MA更明顯（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見圖24。LC3- 16KDaGAPDH36KD

16、aSham Model 3-MA EGCGSham Model 3-MA EGCG*A 缺血30minB缺血/再灌注1h 圖2大鼠心肌組織LC3-蛋白表達(dá)（*P<0.05, *P<0.01 vs.Model）Beclin-1 60KDaGAPDH36KDaSham Model 3-MA EGCGSham Model 3-MA EGCG*A 缺血30min B缺血/再灌注1h 圖3 大鼠心肌組織Beclin-1蛋白表達(dá)（*P<0.05, *P<0.01 vs.Model）mTOR 289KDaGAPDH36KDaSham Model 3-MA EGCGSham Model

17、 3-MA EGCG*A 缺血30min B缺血/再灌注1h 圖4大鼠心肌組織mTOR蛋白表達(dá)（*P<0.05, *P<0.01 vs.Model）4 結(jié)論自噬5是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程，通過形成自噬體降解其底物。LC3-和3-MA分別是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物和自噬抑制劑6。自噬的發(fā)生機制、調(diào)控因素及藥物干預(yù)是目前心肌缺血再灌注損傷研究的熱點。多個研究表明自噬在MIRI中起“雙刃劍”的作用7-9：缺血妻子是輕度增加，可抑制凋亡、促進細(xì)胞存活；但在再灌注期自噬異常增加，反而加重心肌損傷。本研究結(jié)果顯示，EGCG能抑制再灌注自噬的發(fā)生，降低iNOS

18、，提高T-AOC，減少心肌損傷標(biāo)志物CK-MB的含量，保護心肌。自噬的調(diào)控主要通過兩種途徑10-12，一是mTOR介導(dǎo)的自噬/mTOR互反饋信號通路：在自噬初期，mTOR通過對自噬的負(fù)調(diào)控誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，促進細(xì)胞存活；自噬后期，mTOR則主要受PI3K-Akt-mTOR通路調(diào)節(jié)而被激活，抑制自噬。從圖24中可見，在缺血期，EGCG雖然下調(diào)LC3-蛋白表達(dá)，但同時上調(diào)mTOR表達(dá)，在整體動物中可最終通過mTOR的負(fù)調(diào)控作用誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，減少心肌細(xì)胞損傷。自噬的另一種調(diào)節(jié)方式為mTOR非依賴性調(diào)節(jié)機制，是型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3K）通過增加Beclin-1蛋白的表達(dá)而誘發(fā)自噬7-11。本實驗結(jié)

19、果顯示EGCG可下調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá)而抑制自噬過度表達(dá)，保護受損心肌?？傊?，自噬與心血管疾病有著密切的關(guān)系，EGCG可能通過調(diào)控不同時段自噬的發(fā)生而產(chǎn)生抗心肌缺血再灌注損傷作用，其詳細(xì)機制還有待進一步研究。參考文獻(xiàn)1李東，劉秀華，史大卓.細(xì)胞自噬與心血管疾病J.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2012，33(5)：431-436.2Singh B N，Shankar S，Srivastava R K. Green tea catechin，epigallocatechin-3-gallate （EGCG）: Mechanisms，perspectivesand clinical applica

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