基因工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2011級(jí)生物技術(shù)專業(yè)（僅供參考）基因工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)第一章 緒論1.克?。寒?dāng)它作為名詞使用時(shí)，是指從一個(gè)祖先通過無性繁殖方式產(chǎn)生的后代，或具有相同遺傳性狀的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體；當(dāng)它作為動(dòng)詞使用時(shí)，是指從同一祖先生產(chǎn)這類同一的DNA分子群或細(xì)胞群的過程。因此，基因工程也可稱為基因克隆或DNA分子克隆。 2.基因工程誕生于1973年。3.在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中，理論上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明對(duì)基因工程的誕生起到了決定性的作用。1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)（1）40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA而不是蛋白質(zhì)。 （2）50年代明確了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和

2、半保留復(fù)制機(jī)理。（3）60年代確定了遺傳信息的傳遞方式，即中心法則的建立和遺傳密碼子的破譯。2）技術(shù)上的三大發(fā)明（1）利用限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片段。（2）質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片段克隆。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的使用打開真核生物基因工程的一條通路。4.基因工程：對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)-基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體(質(zhì)粒、噬菌體、病毒等)轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。五個(gè)方面的工程技術(shù)系統(tǒng)（基因、細(xì)胞、酶、微生物發(fā)酵、生化工程）是相互依賴、相輔相成的，但系統(tǒng)中基因工

3、程占主導(dǎo)地位。5.基因工程研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)主要步驟：（1）從現(xiàn)有的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等方法，獲得帶有目的基因的DNA片段。（2）在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成能夠自主復(fù)制的重組DNA分子。（3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適宜的受體細(xì)胞，并使其一起增殖。（4）從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。（5）由篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。（6）將分離到的目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。6.基因

4、工程的四大要素：目的基因、工具酶、載體、受體。7.1976年6月23日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）正式公布了“重組DNA研究的安全準(zhǔn)則”。 8.我國(guó)的基因工程相關(guān)法規(guī)：1990年制定基因工程產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；1993年發(fā)布基因工程安全管理辦法；1996年發(fā)布農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實(shí)施辦法；2001年發(fā)布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例 第二章 基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)1.操縱子：由幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列而組成的一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位，稱為操縱子。如：調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因共同組成一個(gè)操作子。 2.內(nèi)含子：是一個(gè)基因中非編碼DNA片段，它分開相鄰的外顯子。 3.外顯子：是

5、一個(gè)基因中編碼蛋白序列。嚴(yán)格地說，外顯子是指保留在初級(jí)mRNA中不被剪切掉的區(qū)域，包括5非翻譯區(qū)(5UTR)、編碼序列和3非翻譯區(qū)(3 UTR)。 4.GT-AG法則：序列分析表明，幾乎每個(gè)內(nèi)含子5端起始的兩個(gè)堿基都是GT，3端最后兩個(gè)堿基總是AG，由于這兩個(gè)堿基的高度保守 性和存在的廣泛性，有人把它稱為GT-AG法則，即5 GT AG 3。 5.衛(wèi)星DNA：真核生物基因組中高度重復(fù)的DNA，有一些2030bp的極短序列，且以數(shù)千個(gè)拷貝的串連方式排列，這種序列稱為衛(wèi)星DNA。（在染色體DNA片段的氯化銫密度梯度離心中，由于浮力密度的不同，這種重復(fù)序列在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶，因此稱之為衛(wèi)星

6、DNA。）6. Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用： A、用Poly（T）作為合成cDNA第一鏈的引物； B、用Poly（T）純化柱從總RNA中分離mRNA。7.可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。 可阻遏調(diào)節(jié)是指基因平時(shí)都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)和酶的工作過程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)，所以稱為可阻遏基因。8.基因工程操作中應(yīng)注意的真核生物與原核生物的差異基因結(jié)構(gòu)的差異啟動(dòng)子和RNA聚合酶的差異蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工（前體切割、二硫鍵、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、

7、乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化）基因表達(dá)的調(diào)節(jié)（表達(dá)量）載體的差異蛋白質(zhì)的純化方便9. 結(jié)構(gòu)基因是可以轉(zhuǎn)錄成為各種RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者轉(zhuǎn)錄 成信使RNA(mRNA)然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶。 從廣義上講，任何一種能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因都可叫做調(diào)節(jié)基因，一般情況下則是指基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)別的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后由mRNA翻譯成阻遏蛋白質(zhì)或激活蛋白質(zhì)，通常也稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。它們通常結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)的順式元件上起調(diào)控作用。 10.具有相同遺傳信息的個(gè)體細(xì)胞間其所利用

8、的基因并不相同，有的基因活動(dòng)是維持細(xì)胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細(xì)胞或受到外界刺激的細(xì)胞中活動(dòng)。前者稱為管家基因，如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被稱為奢侈基因。11.假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達(dá)或表達(dá)異常，生成無生物活性的多肽。12.基因組是指一個(gè)生物體、細(xì)胞器或病毒的全部基因。原核生物基因組僅由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，它的基因組就是它的整個(gè)染色體。但對(duì)于二倍體的高等生物，能維持配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體構(gòu)成的一個(gè)基因組。對(duì)于植物細(xì)胞而言，則有3個(gè)基因組，即染色體基因組(核基因組

9、)、線粒體基因組和葉綠體基因組。13.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA（1）原理DNA雙鏈在強(qiáng)堿條件下變性為DNA單鏈，而單鏈在中性條件下又可復(fù)性為雙鏈。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；染色體線性DNA和（或）有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。（2）所用試劑溶菌酶【在堿性條件（pH>8）下有活性。】：能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中 的b-1，4糖苷鍵。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。EDTA ：Mg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止

10、DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS：溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA 酶）變性沉淀。 NaAc-HAc緩沖液（冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8）：用來中和NaOH變性液，使 DNA復(fù)性?！靖邼舛鹊腘aAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。】乙醇：用于沉淀DNA。（DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán) 境。）RNase A ：降解RNA，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE緩沖液 ：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制

11、?！綯ris-HCl不含金屬離子（不同于 磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解?！糠?氯仿: 蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留 在DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。14.計(jì)算DNA濃度：ssDNA：ssDNA=33×（OD260OD310）×稀釋倍數(shù)dsDNA：dsDNA=50×（OD260OD310）×稀釋倍數(shù)ssRNA：ssRNA=40×（OD260OD310）×稀釋倍數(shù)15.衡量提取DNA 的純度OD260/OD280 1.

12、8 可能有RNA污染OD260/OD280 1.8 可能有蛋白質(zhì)污染16.帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。17.瓊脂糖凝膠電泳的原理：溴化乙錠（EB）是扁平分子，能插入DNA堿基之間， 300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。18.相同分子量的DNA： 閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。19.瓊脂糖凝膠的分辨力：空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎。直媛矢撸盒》肿虞^易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。20.影響DNA瓊脂

13、糖凝膠電泳遷移率的因素有哪些？（1）DNA分子的大小。（2）DNA的構(gòu)象。（3）瓊脂糖濃度。（4）溴化乙錠使DNA遷移率下降15%。（5）電壓。（6）電泳緩沖液的成分及濃度。21.聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。（瓊脂糖凝膠電泳：分離30050000bp；聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離11000bp）22.核酸的分子雜交：Southern blot-用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。Northern blot-用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。原位雜交-對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。23.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reac

14、tion）技術(shù)是利用酶促反應(yīng)在體外指導(dǎo)特定DNA序列擴(kuò)增的方法，以熱變性的雙鏈DNA分子為模板，利用引物和四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為原料在DNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增了特定的DNA片段。 1986年 H.A. Erilish從嗜熱水生菌分離出耐高溫的Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段（37)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中，使PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。PCR技術(shù)的原理：模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸引物：人工合成的單鏈DNA小片段，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5端相同

15、。引物為什么優(yōu)先與模板互補(bǔ)配對(duì)？（濃度高，配對(duì)序列短）PCR的特點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng) （2）敏感性高 （3）快速 （4）簡(jiǎn)便 （5）可以擴(kuò)增mRNA Taq DNA聚合酶的特點(diǎn)：（1）熱穩(wěn)定性，最適溫度高（為75-80）；（2）具有5®3聚合酶活性和5®3外切酶活性，但沒有3®5外切酶活性；（因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)?。?）Taq的PCR產(chǎn)物3端往往帶有一個(gè)A；（4）Taq DNA聚合酶的激活劑，金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。 Pfu DNA Polymerase：有3 ®5的外切酶活性，5 ®3外切酶活性。是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA

16、聚合酶中出錯(cuò)率最低的。但PCR產(chǎn)物為平端！ 影響 PCR的因素：（1）DNA聚合酶活性 （2）引物（3）模板（純度、模板的量）（4）dNTPs（5）Mg 2+ 的濃度引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題有：1）引物的位置：與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3端序列互補(bǔ)（5端相同）；2）引物的長(zhǎng)度：一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)1530bp；3）盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力，堿基隨機(jī)分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右；4）避免形成引物二聚體；5）避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列；6）3端堿基最好選T,C,G而不選A,這樣有利于延伸；7）3端必須與模板正確配對(duì)，5端可以不配對(duì)，5端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切

17、酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便于以后操作。注-引物的Tm值手工計(jì)算：Tm=（G+C)´4 + (A+T)´2標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 100ul 25ul1. 引物 各0.1umol2. 4種dNTP 各200umol/L3. 10× buffer 10ul 2.5ul4. 模板DNA 0.12ug 0.0250.5ug5. Taq酶 2.5u 0.625u6. Mg2+ 1.5mmol/L7. ddH2O 加至100ul 加至25ul如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引

18、物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。套嵌引物：設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。PCR技術(shù)的延伸技術(shù)：（1） 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 【Realtime  PCR（或TaqMan  PCR）】 借助于熒光信號(hào)來檢測(cè)PCR產(chǎn)物。可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。 Ct值：樣品到達(dá)閾值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 （2）反向PCR 擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列。技術(shù)關(guān)鍵：把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。（3）不對(duì)稱PCR 用于擴(kuò)

19、增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測(cè)序。技術(shù)關(guān)鍵：兩個(gè)引物的濃度相差100倍。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR) 擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（5）巢式PCR（Nest-PCR）（6）原位PCR(in-situ PCR)（7）錨定PCR（anchored PCR）定義：擴(kuò)增已知序列側(cè)翼未知序列的一種PCR方法，未知的3端添加一同聚物尾（polyG），以互補(bǔ)的同聚物引物（polyC）和按已知序列設(shè)計(jì)的引物一起作PCR擴(kuò)增。關(guān)鍵：利用末端轉(zhuǎn)移酶在未知一端創(chuàng)造引物結(jié)合位點(diǎn)。（8）長(zhǎng)片段PCR（ Long P

20、CR）（9）多重PCR（ multiplex PCR）定義：又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。 （10）RAPD【隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplification polymorphism DNA, 簡(jiǎn)稱RAPD標(biāo)記)】定義：用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般6-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。（11） AFLP【擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱AFLP 標(biāo)記）】（12）RFLP【限制性片段長(zhǎng)度多

21、態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱RFLP 標(biāo)記）】（13） SSR簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱SSR標(biāo)記）微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個(gè)核苷酸（15個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，廣泛分布在染色體上。 （14）ISSRISSR（inter-simple sequence repeat）重復(fù)序列的間隔序列的擴(kuò)增（15） SSCP分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism)PCR技術(shù)的應(yīng)用：（1）擴(kuò)增某一段DN

22、A （2）基因的體外誘變（3）基因組的比較研究 24.雙脫氧鏈終止法原理：（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行的。 （2）脫氧核糖的連接是以3®5磷酸二酯鍵。 （3）復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。 （4）2和3雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終止。 （5）各堿基隨機(jī)終止產(chǎn)生所有不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物。（6）根據(jù)電泳條帶的先后次序，讀出合成鏈堿基序列，互補(bǔ)配對(duì)推出模板鏈堿基序列。技術(shù)要點(diǎn)：（1）制備單鏈DNA模板（2）特殊的DNA多聚酶不能有5®3和3®5的外切酶活性；與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。（3）制備2和3雙脫氧的ddNTP（dNTP / ddNTP

23、 = 100 / 1）（4）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）注-化學(xué)裂解法讀出的序列就是要測(cè)的序列。Sanger測(cè)序法讀出的序列是新合成的互補(bǔ)鏈序列。第三章 基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶1.定義：一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。2.限制作用：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。這是維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。修飾作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。這是宿主細(xì)胞識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳

24、物質(zhì)的作用機(jī)制。3.類型：I 型、II型、III型4. II型限制性內(nèi)切酶（分離的第一個(gè)酶是Hind ）（1）識(shí)別位點(diǎn)序列: 未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與 DNA的來源無關(guān)。（2）切割位點(diǎn): 識(shí)別位點(diǎn)處。（3）同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。 不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。（4）同尾酶：識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。注：同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。（5）如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。EcoR I和BamH I等都有*活性。（

25、6）s型限制性內(nèi)切酶移動(dòng)切割：s型限制與修飾系統(tǒng)，與型具有相似的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的(不是從識(shí)別位點(diǎn)序列中間斷裂），長(zhǎng)度為 4-7bp ，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。在離它的不對(duì)稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。應(yīng)用：基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是以DNA序列測(cè)定為基礎(chǔ)分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長(zhǎng)度超過9-10個(gè)堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個(gè)序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例可分析所對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)頻率。5.命名：（1）用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩

26、個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。（2）用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoR I）。（3）如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。（4）限制酶前面要帶上R（Restriction)， 修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。6.識(shí)別序列的長(zhǎng)短與切割頻率：識(shí)別序列越長(zhǎng)，切割頻率越?。ㄔ蕉?，越大）7.相鄰序列效應(yīng)：大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)只含識(shí)別序列的寡核苷酸是不具催化活性。 位點(diǎn)偏愛：不僅側(cè)翼序列長(zhǎng)短與限制性核酸內(nèi)切酶的切割效率有關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)側(cè)翼序列的核苷酸組

27、成與切割效率也有關(guān)系。8.影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1）DNA的純度 2）DNA的甲基化程度 3）溫度（大多數(shù)是37 ，少數(shù)要求40-65 ）4）緩沖液 9.完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。（通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。）10. 幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)：二、DNA連接酶1.兩種DNA連接酶：（1）大腸桿菌連接酶（只能連接粘性末端）（2）T4噬菌體的連接酶（不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端）2.連接條件：（1）必須是兩條雙鏈DNA；（2）DNA 3端有游離的-OH，5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）；（3）

28、需要能量：動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：NAD+3.影響連接反應(yīng)的因素：1）插入片段與載體的濃度比例 插入片段濃度高，至少21。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。2）反應(yīng)溫度（一般1416）三、DNA聚合酶1.常用的DNA聚合酶的共同特點(diǎn)：把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端。A、都以dNTP為底物。B、都需要Mg2+激活。C、聚合時(shí)必須有模板鏈和具有3-OH末端的引物鏈。D、鏈的延伸方向都為5'3'。主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。2.用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶I 可以切掉N端的5®3外切酶活性部分，就成為Klenow

29、 fragment。3.切口平移法：DNA聚合酶I 同時(shí)具備5®3外切酶活性和5®3的聚合酶活性（以及3®5外切酶活性）。5®3外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的上一段DNA的3一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。4.放射性標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單、高比放射性、放射自顯影效果好。 缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對(duì)人體有害、要求在專門 實(shí)驗(yàn)室操作。5.地高辛的識(shí)別抗地高辛抗體，生物素的識(shí)別親和素6.常用的兩種偶聯(lián)酶：辣根過氧化物酶（HRPO）、堿性磷酸酶（AP）作用：催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光

30、（或生成有色的產(chǎn)物）。7.用非放射性標(biāo)記的探針檢測(cè)原理：探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。四、DNA修飾酶（一）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的特性： 需要3OH、二甲胂酸緩沖液； 不需要模板； 底物可以是單鏈DNA、3OH突出的雙鏈DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以； 隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。（2） T4多核苷酸激酶的功能：催化g磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5-OH 端。不論5-OH端突出與否。（三）堿性磷酸酶1.種類：細(xì)菌性堿性磷酸酶（BAP）：從

31、大腸桿菌中分離出來，具有抗熱性。 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）：從小牛腸中純化出來，SDS中加熱68可完全失活。2.特性：催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3.功能：防止線性化的載體份子自我連接（四）S1核酸酶1.特性：（1）高度單鏈特異性（2）反應(yīng)條件： 低水平Zn2+ pH4.04.32.功能：（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。（3）降解限制酶切形成的單鏈突出端。（4）不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈。第4章 基因工程載體質(zhì)粒載體的容量相對(duì)較小，受轉(zhuǎn)化率、拷貝數(shù)的影響。M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達(dá)其DNA長(zhǎng)度的6倍。6407bp*6噬菌粒能

32、插入10kb的外源DNA。l載體的最大克隆容量是23kb。（實(shí)際上為15kb）柯斯質(zhì)粒45kb。（最少不能低于30kb）細(xì)菌人工染色體克隆容量可達(dá)300kb。載體的定義 廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體?；蚬こ虒?duì)載體的要求（1）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，可用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。（4）具有合適的選擇標(biāo)記，便

33、于重組DNA分子的檢測(cè)。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類造成危害。載體的種類1）按來源基因工程中常用的載體有5類：質(zhì)粒、單鏈DNA噬菌體M13、l噬菌體的衍生物、柯斯質(zhì)粒、動(dòng)物病毒 2）按功能分：克隆載體-克隆一個(gè)基因或DNA片段 表達(dá)載體-用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 整合載體-把一個(gè)基因插入到染色體組中一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒：是獨(dú)立于染色體以外能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。2.氯化銫密度梯度離心結(jié)果自上而下依次為：蛋白質(zhì)、ocDNA/L-DNA、cccDNA、RNAs3.質(zhì)粒的類型：1）依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分類在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒-能

34、自我轉(zhuǎn)移 非接合型質(zhì)粒-不能自我轉(zhuǎn)移2）依據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分類顯性質(zhì)粒：宿主細(xì)胞由于含有質(zhì)粒而獲得新性狀隱蔽質(zhì)粒：宿主細(xì)胞含有此類質(zhì)粒而無異樣性狀3）依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類A. 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。B. 松弛型質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。4.質(zhì)粒的不親和性：能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒。不能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)?；虿幌嗳菪再|(zhì)粒。親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒，如野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒往往屬于不親和性質(zhì)粒。 5.第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長(zhǎng)9.1 kb。6.

35、人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（3）失控的質(zhì)粒載體（4）插入失活型質(zhì)粒載體（5）正選擇的質(zhì)粒載體（6）表達(dá)型質(zhì)粒載體7.利用質(zhì)粒載體將真核生物基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),該質(zhì)粒載體應(yīng)具備哪些元件?1）普通載體元件：復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件：阻遏基因I、操縱基因O、啟動(dòng)基因P、核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）、 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)8. pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。9.藍(lán)白斑選擇原理：1） Xgal2） b-半乳糖苷酶Xgal顯色反應(yīng)：b-半乳糖苷酶能把無色的化合物 Xga

36、l分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。3） lacZ的a肽互補(bǔ) a-肽（ lacZ ）： b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。 lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能。 受體菌lacZ突變 受體菌基因組的b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽）， 不能形成4聚體的活性酶，不能分解Xgal 。 載體lacZ與a互補(bǔ)pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼a肽與這個(gè)缺失突變的b-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。 a互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止

37、LacZ的合成。不能互補(bǔ)。4） IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZa肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生a肽！IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：MCS無插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑；MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。10. 穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。11. TA克隆載體：研制出的一種線形質(zhì)粒，其3端各帶一個(gè)不配對(duì)脫氧胸腺嘧啶核苷（T），采用該質(zhì)?？蓪CR產(chǎn)物以TA連接的方式直接進(jìn)行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被

38、稱為TA克隆載體。（原理：Taq酶特點(diǎn)）12. 質(zhì)粒載體增加寄主新陳代謝負(fù)荷：復(fù)制負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷 （使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩；丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體。）13. 原噬菌體：整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì) 菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。14. M13噬菌體沒有包裝限制：M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達(dá)M13DNA長(zhǎng)度的6倍。6407bp*615. 噬菌粒載體：由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。16.噬菌體展示：將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。17.cos位點(diǎn)：DNA兩端各有12b

39、p的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。18.pBluescript SK/KS（+/-）區(qū)分：SK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI ® KpnI KS：反向（ KpnI ® SacI ，MCS相反）+（f1+）：?jiǎn)捂湉?fù)制起始方向背離lacZ，能回收l(shuí)acZ的編碼鏈（+）-（f1-）：能回收l(shuí)acZ的非編碼鏈（-）19.噬菌粒載體的包裝：1） 輔助噬菌體：自身的復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。噬菌體2） 包裝：外殼蛋白和復(fù)制蛋白輔助噬菌體ssDNA噬菌粒載體20. l載體的體外包裝（1

40、）定義：在試管中與l噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。（2）l噬菌體外殼蛋白的合成E 基因：l的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因：l的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與l DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。注-l噬菌體體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%-105%（3651kb）之間。21.cosmid載體（粘粒）1）組成：l DNA：cos序列和控制包裝的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子；抗藥性基因；幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)。2）特點(diǎn)：具有l(wèi)噬菌體的特性：在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但

41、不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌）?？寺⊥庠碊NA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。方便的選擇：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。3）應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。理論依據(jù)：cos位點(diǎn)：包裝識(shí)別?！岸嗦?lián)體”復(fù)制：l噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)lDNA通過cos位點(diǎn)連接的“多聯(lián)體”分子。Ter體系：在包裝的時(shí)候，l噬菌體具有位點(diǎn)特異的末端酶體系（Ter體系），識(shí)別cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成

42、單個(gè)lDNA長(zhǎng)度。包裝限制：兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持3845kb的DNA，Ter體系才能識(shí)別。野生型l 噬菌體DNA的75105。22.酵母人工染色體（YAC）的特點(diǎn)：（1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。YAC的組成結(jié)構(gòu)：（1）著絲粒區(qū)（CEN）（2）端粒（TEL）（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）（4）克隆位點(diǎn)（5）在酵母中的標(biāo)記基因（6）在細(xì)菌中操作的復(fù)制起點(diǎn)ori和抗生素標(biāo)記Ampr 23.染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori）、著絲粒（cen）、兩個(gè)端粒（tel）24.F質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）單拷貝復(fù)制。

43、（2）克隆容量可達(dá)300kb。（3）比較穩(wěn)定。 （4）便于提純。第5章 目的基因的獲取目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因1.關(guān)于亞磷酸三酯法：化學(xué)合成的方向：3®5；核苷酸單體的磷酸基團(tuán)在3端；亞磷酸三酯法的磷為3價(jià)磷，需要氧化。2.寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)：1）直接合成基因：mRNA的含量很低，很難作cDNA 有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低2）合成引物（20mer左右）3）合成探針序列4）定點(diǎn)突變合成5）合成人工接頭或銜接物6）合成DNA芯片3.銜接物：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。人工接頭：用化學(xué)合成法合成的一段不等長(zhǎng)雙

44、鏈DNA序列，一頭平末端、另一頭粘性末端（為某種酶切所產(chǎn)生的粘性末端）。4.基因文庫(kù)：將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片段，并將所有這些片段都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫(kù)。5.基因組文庫(kù)的大?。阂粋€(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-f )P：文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）F：插入載體的DNA片段的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）文庫(kù)的查詢：用目的基因探針與文庫(kù)中的重組載體進(jìn)行Southern blot雜交

45、。6.cDNA：以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA。cDNA library：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。7.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)：（1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。 （3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。 （4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。cDNA文庫(kù)的大?。阂粋€(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-1/n)P：文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）1/n：某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）8

46、.cDNA的合成： cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 降解mRNA模板 用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。 cDNA第二鏈合成 剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 用核酸酶S1可切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。9.妙用RNaseH 這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片段。小片段正好成為DNA聚合酶的引物，用

47、來合成岡崎片段。 DNA Pol I除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。10. mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。 從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。 將表達(dá)A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。 不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。 用羥基磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。11. mRNA差異顯示PCR（DD RT-PCR）（1）3端的錨定引物 Oligo(dT)引物的3端加兩個(gè)核苷

48、酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。（2）12種錨定引物（3）5端的隨機(jī)引物（4）隨機(jī)引物與錨定引物成對(duì)擴(kuò)增（5）隨機(jī)-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較 不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。選擇有差異的帶，進(jìn)一步PCR作探針。篩選文庫(kù)，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。12.cDNA差示分析法：1）cDNA模板制備；2）用DpnSau 3A分別消化兩組cDNA，再接上接頭R，經(jīng)補(bǔ)平末端后作為下一步PCR擴(kuò)增的模板；3）加入根據(jù)R設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，利用PCR技術(shù)使兩組的cDNA片段得以富集后，再用DpnSau 3A去除cDNA兩端的R；4）消減雜交。將上一步獲得的tester的cDNA接上新的接頭J，按t

49、ester:driver為1：100的 比例混合兩組cDNA，在一定的反應(yīng)體系中解鏈并進(jìn)行充分的雜交反應(yīng)，這樣便有3種 形式的雜交體形成，即A driver：driverB driver：testerC tester：tester；5）利用PCR反應(yīng)使tester的特異基因得以富集。A不能擴(kuò)增、B線性擴(kuò)增、C 指數(shù)擴(kuò)增。13.盒式PCR（Cassette PCR）是利用Cassette(人工合成的帶有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶粘末端較長(zhǎng)的雙鏈DNA分子)和Cassette上的引物，特異性擴(kuò)增目的基因組DNA未知區(qū)域的一種有效的方法。 14.RACE技術(shù) RACE（Rapid Amplification

50、of cDNA ends）是一種通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一條鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3或5之間的未知序列的方法,分別稱為3-RACE或 5-RACE。錨定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技術(shù)，經(jīng)典RACE就是基于錨定PCR技術(shù)原理設(shè)計(jì)的，而高特異性的RACE是借助于反向PCR技術(shù)。15.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 轉(zhuǎn)座子是一類可以在同一條染色體不同位點(diǎn)或不同染色體間轉(zhuǎn)移的一段特殊的DNA。 16. 圖位克隆法：根據(jù)目的基因在基因組上的位置特性而不是其編碼產(chǎn)物來進(jìn)行基因克隆。17.染色體步移：利用與目的基因緊密連鎖的

51、標(biāo)記DNA片段為探針篩選基因組文庫(kù)，用已獲得的陽(yáng)性克隆的DNA片段的末端DNA為探針繼續(xù)篩選，如此進(jìn)行下去，直到獲得含目的基因兩側(cè)序列為止。18.染色體步移往往因?yàn)榈貌坏街丿B克隆而被打斷造成前功盡棄或因?yàn)榛蚪M的復(fù)雜性高而遇到重復(fù)序列改變步移方向誤入歧途。如能找到與目的基因的物理距離小于基因組文庫(kù)的平均插入片段的長(zhǎng)度的緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可以通過篩庫(kù)直接獲得含目的基因的大片段克隆，接著從中分離出目的基因。這樣就完全避開了步移，這種方法稱為染色體登陸。 19.酵母雙雜交系統(tǒng)1）作用：有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)2）原理：結(jié)構(gòu)域（Domain）合作： 許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子

52、都是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)-只要DNA binding domain（DNA-BD）與Active domain（AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。拆開 Domain：用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個(gè)Domain分開，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。重組Domain： 用重組DNA技術(shù)把這兩個(gè)Domain分別與兩個(gè)不同的多肽連接。觀察報(bào)告基因表達(dá)：通過效應(yīng)基因是否被激活來檢查：在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。.如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合 GAL4的DB domain與AD Domain也不能靠近，所以

53、仍然不能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。.如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合GAL4的DB domain與AD Domain也能靠近，所以能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。第6章 基因的重組與轉(zhuǎn)移外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞一、齊平末端的連接1. 直接連接 5端與3端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接；T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 原理：DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。加尾堿基互補(bǔ)：分別給載體和插入片段加上互補(bǔ)的核苷酸。（2）銜接物(linker)連接 linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。 linker的作用：用T4 DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（3）DNA接頭 (adapter)連接法 adapter：一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用：用T4DNA連接酶連到平端DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。二、PCR產(chǎn)物的連接1. 在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)（1）設(shè)計(jì)原則：符合載體的多克隆位點(diǎn)；避免與所擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)：3端1