測序結(jié)果分析教學(xué)文案

1、測序結(jié)果的判讀測序結(jié)果為.abi格式，可用軟件chrosmas打開，一種顏色的峰代表一個堿基，峰的高低表 信號的強(qiáng)弱。一個正常的N表示機(jī)器沒法判讀是哪種堿基，原因是：雜峰的信號高于機(jī)器默認(rèn)的值，機(jī)器會認(rèn)為該處有兩個峰，因此不能判斷確定是哪個峰，需要人工判讀。以下三 種情況會出現(xiàn)N :有雜合子，有雜峰，反應(yīng)已結(jié)束。3393493I9Q300470士克 C止 TJtCCJkLi；匚 CTTTCCE I：匸 TGGdJLlCii：!' 匚匚 ETfLTCIZGC： T 匚 TCCTItTTCC&ACCCTGC 匚 GE T質(zhì)粒污染(Two plasmid)ICTOnFTTSGTCCT

2、TTFCCEH：CTTTCRTCCTTlCFCWirHK TQTre1 HHfifTBFWIIHEi"(MZflfflMZEFiTHHWTOFITHT!=眈-TltEWIC 70cDQD1003L1 20119014EI15011割膠純化后1n>«1.,吟卩眄.T T ICRC T D C A T ®T «Cfl ®Rtm S GTHTRTirTTCT « TQT 1 C R I 6 CTBIT II 冃 It 丨HWiS*£_測序產(chǎn)物純化BigDye<J»I nil I IjfcPL1、liMiJD

3、4-!r3Kja jb Jk * G-B； l HHEBSiLrhjk -4UJItl>««lINIII>1UPiU鼻！3JOJil減MMMMiMmL堿血馬血/MmNM 鹹 nCHriFl k lut-lh h原因：測序產(chǎn)物純化不夠注意：染料峰位于序列的前100堿基以內(nèi)；酒精峰位于序列的 220 320堿基之間釘子峰產(chǎn)生的原因是樣品或毛細(xì)管內(nèi)有灰塵等固體小顆粒序列凌亂原因：測序反應(yīng)失敗。解決辦法：改進(jìn)條件，重做反應(yīng)。注意兩個關(guān)鍵因素：引物與模板之間的比例：3.2 pmol:200 ng。模板 DNA的純度和用量： 1.6 2.0T峰特別弱原因：殘余的 Dye太多

4、，純化不夠。有測序反應(yīng)，但效率低下信號太弱解決辦法：純化充分。避開引物峰，確定新的分析起點1、PCR產(chǎn)物測序時岀現(xiàn)重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼）Ia C C r T <3 T C Q T <J C G C T T CHTTTTWaGNGC C C C T TQ Q <解決方法：將 PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測序，或?qū)?PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE 純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序。問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）hbi解決方法：主要原因是PC

5、R產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序，便可解決。冋題圖3（測序引物有堿基缺失）CTT NT VC T! TJ； C 7Cf< ' TTJ-G C77C ' CCG 7 TG NG測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖 1有些類似，所不同 的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼， 而引物堿基缺失的話，則從測序一 開始就岀現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行 PAGE純化2、克隆測序時

6、岀現(xiàn)峰形重疊粒；或是是送測序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y序。3、樣品有雜合/突變位點模板中有雜合型突變， 也就說模板本身在這個位點岀現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增岀來的雜合位點。如果模板有雜合 （突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然 后突然在某一個位點岀現(xiàn)重疊峰（如圖中箭頭所示）。解決方法：建議將 DNA片段克隆到載體再測序。4、polyA/T 和C/Gcluster 導(dǎo)致的套峰和測序信號衰減RACE測序時經(jīng)常遇到圖 4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；或者構(gòu)建載體 進(jìn)行測序。5、基因中含有重復(fù)序列ztei cc?t cccrtcff* .cccr -jjc: rccrr rcc；ere: xzit ere* :cr > ccc:c:：7 岫zbb可能的原因：樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會導(dǎo)致 Fra