蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見問題

1、免疫印跡技術(shù)的基礎(chǔ)免疫印跡技術(shù)的基礎(chǔ)- -免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)% 免疫測定(immunoassay) 利用抗原抗體 反應(yīng)來測定標(biāo)本中抗原或抗體的方法 % 檢測對象：具體免疫活性的物質(zhì) % 反應(yīng)特性：高度的特異性和敏感性Western Blot原理簡介+ Western Blot一般流程+ Western Blot常見問題分析內(nèi)容概要內(nèi)容概要 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。Western Blot 原理原理 目的蛋白的表達(dá)特性分析 目的蛋白與其它蛋白的互作 目的蛋白的組織定位 目的蛋白的表達(dá)量分析Western Blot 的應(yīng)用的應(yīng)用Wes

2、tern Blot原理簡介+ Western Blot一般流程+ Western Blot常見問題分析內(nèi)容概要內(nèi)容概要Western Blot 流程流程l蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量 不連續(xù)的電泳緩沖體系。 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠成分凝膠成分 N,N-亞甲雙丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配膠的Tris緩沖

3、液 TEMED 過硫酸銨 Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。 半干法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。 轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)膜方法 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探 針的Western印跡過程。 轉(zhuǎn)膜后檢測轉(zhuǎn)膜后檢測轉(zhuǎn)膜后的封閉轉(zhuǎn)膜后的封閉 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或

4、者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉劑，搖床上平緩搖動，于室的量加入封閉劑，搖床上平緩搖動，于室溫溫育溫溫育1-2小時。倒掉緩沖液，立即加入一抗溶液與濾膜溫育。小時。倒掉緩沖液，立即加入一抗溶液與濾膜溫育。 一抗用量也根據(jù)0.1ml/cm2來計算，室溫1-2小時。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液濾膜3次，每次 10min。 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，室溫溫育 1-2小時。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育二抗與底物反應(yīng)顯色二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法堿性磷酸酶法化學(xué)發(fā)光顯色法AntiHis 應(yīng)

5、用舉例：用應(yīng)用舉例：用Western blot檢測患者檢測患者血清中的血清中的HIV病毒抗體病毒抗體Western Blot原理簡介+ Western Blot一般流程+ Western Blot常見問題分析內(nèi)容概要內(nèi)容概要Western blot常見問題常見問題SDS-PAGE電泳電泳1.膠不平？2. 凝膠漏液？1.膠板洗刷干凈2. 加入AP和TEMED的量要合適3. 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻4. 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻5. 兩塊玻璃板底部要對齊1.條帶比正常的窄？2. “微笑”或“倒微笑”條帶？1. 凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩2

6、. 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲3. 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度4. 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適Western blot常見問題常見問題SDS-PAGE電泳電泳？ 1.可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min2. 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的紙片3. 確保膜和膠塊之間沒有氣泡4. 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫Western blot常見問題常見問題轉(zhuǎn)膜及抗體檢測轉(zhuǎn)膜及抗體檢測1.蛋白分子量 10KD2.

7、蛋白的等電點(diǎn)=83. SDS濃度不合適4. 凝膠太厚1.蛋白分子量10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜2. 更換高pH值Buffer3. 在陰極buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率4. 延長轉(zhuǎn)膜時間Western blot常見問題常見問題蛋白轉(zhuǎn)膜效率低蛋白轉(zhuǎn)膜效率低1.膜沒有均勻浸濕2.膜或者緩沖液污染3.封閉不充分4.抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)5.抗體濃度過高1.轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕2. 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度Western blot常見問題常見問

8、題顯色背景高顯色背景高1.抗體保存不當(dāng)2. 抗原不充足3. 膜的漂洗過度1.抗體長期保存應(yīng)在70，使用前做效價檢測2. 增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照3. 減少漂洗的時間和次數(shù)Western blot常見問題常見問題雜交信號弱雜交信號弱1.一抗不是唯一特異的2. 二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合1.制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點(diǎn)2. 設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合Western blot常見問題常見問題顯現(xiàn)非特異性條帶顯現(xiàn)非特異性條帶 分子量Marker：確定蛋白條帶的分子量 已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照 空白載體對照：如果是表達(dá)蛋白需要做表達(dá)前的 內(nèi)參：看家基因編碼表達(dá)的蛋白 參照體系參照體系TIANGEN產(chǎn)品結(jié)構(gòu)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)底物顯色液底物顯色液HRP底物顯色液底物顯色液HRP-DAB底物顯色試劑盒底物顯色試劑盒增強(qiáng)型增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒底物顯色試劑盒沉淀型單組分沉淀型單組分TMB底物溶液底物溶液可溶型單組分可溶型單組分TMB底物溶液底物溶液Pro-light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測試劑化學(xué)發(fā)光檢測試劑 AP底物顯色試劑底物顯色試劑BCIP/NBT底物顯色試劑盒底物顯色試劑盒HRP-DAB底物顯色試劑底物顯色試劑盒盒Western blot中的應(yīng)用中的應(yīng)用HRP-DAB底物顯色試劑底物顯