基因工程重點(diǎn)

1、電泳的遷移率 (Electrophoretic mobility)：帶電荷的分子被放入電場(chǎng)中時(shí)，會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)姆较?，這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。遷移率大小取決于電場(chǎng)強(qiáng)度，自身電荷量，核酸分子本身的大小和構(gòu)型脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（Pulse alternative field gel electrophoresis，PFGE）應(yīng)用：分離超大分子量的DNA分子。1.Southern blot：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DN

2、A印跡雜交技術(shù)。印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理：分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時(shí)間不同；為了得到一個(gè)更好的轉(zhuǎn)移效果，需要將電泳膠浸泡在0.25M的HCL溶液中脫嘌呤 (堿水解，DNA鏈斷裂)，再進(jìn)行堿變性 (單鏈)。2.Northern blot：1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。Western blot： 將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同帶有特定標(biāo)記的蛋白質(zhì)質(zhì)抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做Western blot。3. 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 它們是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上

3、發(fā)展的兩種類(lèi)式的快速檢測(cè)特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過(guò)程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。2. 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)用CaCl2處理后的大腸桿菌會(huì)進(jìn)入感受態(tài)（0度條件下將生長(zhǎng)的細(xì)菌放入CaCl2溶液中低滲，使得細(xì)胞膨脹形成一種原生質(zhì)球狀態(tài)）。當(dāng)這個(gè)時(shí)候加入外源DNA轉(zhuǎn)化時(shí)，原生質(zhì)球粘附外源DNA形成復(fù)合物，使其免受Dnase的降解，當(dāng)進(jìn)一步的42度熱休克刺激后，這種復(fù)合物被細(xì)胞吸收，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和克隆化生長(zhǎng)即可活得轉(zhuǎn)化狀態(tài)的細(xì)菌。轉(zhuǎn)化成功率決定因素：轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生理

4、狀態(tài)及存活率轉(zhuǎn)化的環(huán)境條件：溫度，pH值，離子濃度等DNA濃度，純度和構(gòu)型：環(huán)形質(zhì)粒比線型的高10100倍限制修飾體系缺失的突變體宿主菌分子量大小與效率成反比質(zhì)?？截悢?shù)：在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基條件下，每個(gè)細(xì)菌中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。根據(jù)寄主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)的多少，可將質(zhì)粒分成：“嚴(yán)緊型”(stringent plasmid)： 13份的拷貝“松弛型”(relaxed plasmid)： 1060份拷貝質(zhì)粒的不親和性/不相容性（plasmid incompatibility） 是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，其中必有一種

5、會(huì)被逐漸地排斥掉?；蚝铣桑?. 磷酸二酯法合成寡核苷酸2.磷酸三酯法合成寡核苷酸3. 固相亞磷酸三酯法合成寡核苷酸4.寡核苷酸片段組裝基因的方式Sanger雙脫氧終止法；核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5端，以雙脫氧堿基為3端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段（長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基），根據(jù)片段3端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。M

6、axam-Gilbert化學(xué)修飾法；將一個(gè)DNA片段的5'端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基（表6-1），從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而5'端被標(biāo)記的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。3. DNA序列分析的自動(dòng)化4. DNA雜交測(cè)序（Sequencing by hybridization，SBH）SBH的原理：如果一段短的DNA探針能夠同較長(zhǎng)的靶序列片段雜交，并形成完全的雙鏈分子，那么可以推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列。2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件具有復(fù)制

7、起點(diǎn) 具有抗菌素抗性基因具若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)簡(jiǎn)答：質(zhì)粒基因編碼合成的抑制蛋白質(zhì)（cop），通過(guò)對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合作用，直接抑制質(zhì)粒分子的的復(fù)制-抑制蛋白質(zhì)稀釋模型抑制蛋白質(zhì)（cop）通過(guò)阻止一種必須的起始蛋白質(zhì)（rep）的合成，而間接地抑制質(zhì)粒分子的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的，Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體蛋白質(zhì)阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過(guò)同啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr蛋白質(zhì)和Rep蛋白質(zhì)處于恒定水平。然

8、后由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則通過(guò)同復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合，來(lái)引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制。Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用，同時(shí)又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制。抽質(zhì)粒方法：1. 氯化銫密度梯度離心法2. 堿變性法3. 微量堿變性法真核表達(dá)系統(tǒng)需要知道外源基因在真核表達(dá)的方式：瞬轉(zhuǎn)、穩(wěn)轉(zhuǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)篩選元件正篩選標(biāo)記的功能：1)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離整合了外源基因的細(xì)胞；2）作為突變?cè)╩utagen)插入或置換靶基因的編碼外顯子，使靶基因產(chǎn)生突變。如常用的Neo基因：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞

9、培養(yǎng)在含有G418的培養(yǎng)基中，沒(méi)有整合外源基因的細(xì)胞將死亡，只有整合了外源基因的細(xì)胞才可以存活下來(lái)。負(fù)選擇法標(biāo)記的功能：用來(lái)對(duì)抗打靶過(guò)程中的非同源重組，起富集中靶克隆的作用。如常用的tk基因：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在含有Ganciclovir(GanC)的培養(yǎng)基中，tk基因表達(dá)的胸苷激酶能將GanC轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，使細(xì)胞死亡。HAT培養(yǎng)基(組分、機(jī)制)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法作為基因工程細(xì)胞株需要的條件細(xì)胞系特征：?jiǎn)适Ъ?xì)胞接觸抑制性和錨定倚賴(lài)性， 便于大規(guī)模培養(yǎng)；遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失， 易于長(zhǎng)期保存；合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持；生長(zhǎng)快且齊：分裂周期短，生長(zhǎng)均一、便于控制；安全性能好

10、：不合成分泌致病特質(zhì)、不致癌轉(zhuǎn)基因技術(shù)路線五步：1、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體 2、將載體轉(zhuǎn)染到宿主胚胎 3、整合到宿主基因組中 4、表達(dá)外源基因 5、篩選founder動(dòng)物總結(jié)：基因打靶的技術(shù)路線：打靶載體的構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞基因在染色體上的定點(diǎn)整合囊胚注射構(gòu)建嵌合體遺傳育種獲得基因打靶動(dòng)物轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物可分為4個(gè)類(lèi)別：Bt農(nóng)作物，可抵御害蟲(chóng)的侵害，減少殺蟲(chóng)劑使用量；抗除草劑農(nóng)作物抗病毒農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)型農(nóng)作物；其特定營(yíng)養(yǎng)組份和維生素含量更高。全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物概況批準(zhǔn)的農(nóng)作物有哪些：大豆、油菜籽、玉米、番木瓜、棉籽油（馬鈴薯、番茄、甜菜）轉(zhuǎn)入的哪些基因黃金大米：脫氫酶、茄紅素合成酶、磷

11、酸甘露糖異構(gòu)酶三文魚(yú)：一個(gè)片段取自名為海洋大頭魚(yú)的鱈魚(yú)的親緣?mèng)~類(lèi)。這種基因促進(jìn)生長(zhǎng)激素的編碼基因的活動(dòng)。另一個(gè)片段取自一種奇努克鮭，本身就含有一種生長(zhǎng)激素基因生物反應(yīng)容器的概況第一個(gè)實(shí)現(xiàn)乳腺反應(yīng)器表達(dá)的藥物是治療哪個(gè)疾病1-抗胰蛋白酶，1-抗胰蛋白酶缺乏癥第一個(gè)在臨床上獲得批準(zhǔn)的是哪個(gè)藥物，針對(duì)哪個(gè)疾病世界上第一個(gè)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物重組人抗凝血酶美國(guó)FDA首次批準(zhǔn)用轉(zhuǎn)基因山羊奶研制而成的生物制品ATryn（-antithrombin）上市。ATryn是一種抗凝血藥，用于罕見(jiàn)的遺傳性抗凝血酶缺乏癥（AT）患者。Crisper原理成簇規(guī)律間隔排列的短回文重復(fù)序列CR

12、ISPR/Cas系統(tǒng)由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)，是細(xì)菌中對(duì)抗入侵的外源DNA(噬菌體或質(zhì)粒）的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。該防御系統(tǒng)包括三部分：1. 將首次入侵的噬菌體或質(zhì)粒的切割DNA 片段整合到染色體CRISPR位點(diǎn)中，形成crRNA（ CRISPR-derived RNA ）；2. crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物；3. 當(dāng)病原再次入侵時(shí)， tracrRNA/crRNA 復(fù)合物引導(dǎo)Cas核酸酶在與crRNA 配對(duì)的外源DNA靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，從而降解外源DNA并提供免疫性。

13、基因工程利用：通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引導(dǎo)Cas9 對(duì)DNA 的定點(diǎn)切割。DNA指紋(DNA fingerprinting)Variable Number of Tandem Repeats（VNTR）：串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性多位點(diǎn)性： 1) 不同位點(diǎn)的VNTR具有相同或相似的核心序列，可以被同一探針識(shí)別2）同一位點(diǎn)的VNTR的拷貝數(shù)存在差異，酶切片段或PCR產(chǎn)物大小有多態(tài)性；高變異性：兩個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體具有相同DNA指紋圖譜的概率極低穩(wěn)定遺傳：遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律Cyclic Array Sequencing: 循環(huán)芯片測(cè)序法對(duì)布滿(mǎn)待測(cè)DNA樣品的芯片循環(huán)進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)以及熒光序列讀取，以實(shí)現(xiàn)序列測(cè)定的方法。這是一種邊合成邊測(cè)序的方法。NIPT: Non-invasive prenatal testing 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)。指通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析母體外周血胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA, cff DNA），從而對(duì)胎兒染色體非整倍體進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，這一技術(shù)在國(guó)際上已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。CAR-T cell:chimeric antigen receptor-modified T cells (嵌合抗原受體T細(xì)胞), 將能識(shí)別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與T細(xì)胞刺激因子