酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定植物激素含量

1、-作者xxxx-日期xxxx酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定植物激素含量【精品文檔】酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定植物激素含量姓名：李希東 專(zhuān)業(yè)：植物學(xué) 學(xué)號(hào)：200808201 日期：0 成績(jī)：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆臻g接法測(cè)定植物激素的原理和方法；了解逆境對(duì)玉米根系A(chǔ)BA和IAA含量的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbert assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immuno enzymite technique)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)免疫測(cè)定技術(shù)。其建立在兩個(gè)重要的生物化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)之上的，即抗原抗體反應(yīng)的高度專(zhuān)一性和敏感性；酶的高效催化特性。EL

2、ISA把這二者有機(jī)地結(jié)合在一起，即被分析物先與其相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，然后再檢測(cè)抗體或抗原上酶標(biāo)記物的活性，從而達(dá)到定性或定量測(cè)定的目的。間接法是將過(guò)量的與蛋白質(zhì)連接的待測(cè)植物激素(實(shí)驗(yàn)前將該激素與牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)連接成激素一蛋白質(zhì)復(fù)合物)吸附在固相支持物上，然后加入待測(cè)植物激素和相應(yīng)抗體，使抗體與待測(cè)植物激素及激素蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，再加入酶標(biāo)抗體(標(biāo)記酶與非特異第二抗體的復(fù)合物)，就形成蛋白質(zhì)·激素·第一抗體·第二抗體·酶復(fù)合物，加入底物后就生成有色產(chǎn)物，測(cè)定其吸光率，可計(jì)算待測(cè)抗原的量。如果抗體、激素一蛋白質(zhì)復(fù)合物和酶標(biāo)抗體的量一定，并且激素&#

3、183;蛋白質(zhì)復(fù)合物和待測(cè)激素的總量超過(guò)抗體的量，那么生成的蛋白質(zhì)·激素·第一抗體·第二抗體·酶復(fù)合物的量就受待測(cè)激素含量的限制，因此待測(cè)抗原的量將與吸光率成反比。圖A表示間接酶聯(lián)免疫方法的基本原理：A.間接酶聯(lián)免疫原理示意圖示反應(yīng)板（固相載體） 示激素特異抗體（一抗）示激素（抗原） 示非特異二抗示蛋白質(zhì)·激素復(fù)合物 示標(biāo)記酶本實(shí)驗(yàn)所采取的方法，則是利用游離抗原和吸附抗原與游離抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白質(zhì)復(fù)合物。根據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)

4、該反應(yīng)體系中Ab及HP的量確定時(shí)，游離H越多，結(jié)合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，RF結(jié)合在板上的抗體就越少，通過(guò)酶標(biāo)二抗檢測(cè)結(jié)合物AbHP的多少，就可以確定游離H量的多少。三、實(shí)驗(yàn)器皿：1、材料：正常條件和NaCl處理下的玉米種子2、儀器:天平、研缽、離心管（5mL）、離心機(jī)、青霉素小瓶、封口膜、培養(yǎng)箱、反應(yīng)板、解剖盤(pán)、紗布、移液槍?zhuān)?000L、100L、50L）、濾紙、酶聯(lián)免疫測(cè)定儀3、試劑:包被緩沖液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，樣品稀釋液，底物緩沖液，洗滌液，終止液，提取液。（緩沖液均放入4冰箱儲(chǔ)存）四、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 樣品中激素的提取（計(jì)量）稱(chēng)取1g 左右材料，加2ml 樣

5、品提取液，在冰浴下研磨成勻漿(一定要磨細(xì))，轉(zhuǎn)入5ml離心管，再用2ml 提取液分次沖洗研缽并轉(zhuǎn)入離心管中，搖勻。在 4下提取4h，30004000rpm 離心1520min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，搖勻，置4下再提取1hr,離心，合并上清液。記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。將一定體積的上清液轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中，吹干（低溫保存），用樣品稀釋液定容(一般1g樣品用1ml樣品稀釋液定容)，搖勻后再用于測(cè)定。2. 樣品測(cè)定（1）包被：向反應(yīng)板中每孔加100L IAA抗原，將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤(pán)內(nèi)，37 保溫3h。 （2）洗板 室溫下平衡，洗滌液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。 （3）競(jìng)爭(zhēng): a、

6、配標(biāo)樣：IAA 稀釋成一系列濃度(2000 ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250、125、0) 8個(gè)。 b、加標(biāo)樣及樣品：每個(gè)濃度加2孔，每孔50L，每個(gè)樣品重復(fù)2孔，每孔50L，邊緣孔不加。 c、加抗體：每孔加50L，將酶標(biāo)板放入濕盒內(nèi)開(kāi)始競(jìng)爭(zhēng)。37 0.5h （4）洗板（5）加底物顯色：每孔加100L (在暗處操作)，然后放入濕盒內(nèi)，當(dāng)顯色適當(dāng)后，即0 ng/ml 孔OD490nm為，而本底即完全抑制孔不超過(guò)，( 兩者之差為1左右 ) 。每孔加入50L 23 mol/L硫酸終止反應(yīng)。 15-20min 比色： 用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高濃度孔調(diào)0，測(cè)定OD490nm 五、實(shí)驗(yàn)記錄1

7、. 酶標(biāo)板加樣記錄表1 酶標(biāo)板加樣圖包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液20001000500250125625包被緩沖液包被緩沖液20001000500250125625包被緩沖液包被緩沖液鹽脅迫根尖1正常根尖1鹽脅迫莖尖1正常莖尖10包被緩沖液包被緩沖液鹽脅迫根尖2正常根尖2鹽脅迫莖尖2正常莖尖20包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液包被緩沖液2. 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表2 不同濃度標(biāo)樣激素測(cè)定值200010005002501250000.98圖1 ABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表3

8、樣品測(cè)定結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照玉米鹽脅迫玉米玉米根部1玉米根部2平均值0.780.780.680.71玉米莖尖1玉米莖尖2平均值5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果ABA含量（ng/ml）對(duì)照玉米鹽脅迫玉米玉米根部1玉米根部2平均值玉米莖尖1玉米莖尖2平均值六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算或分析：ABA可作為植物發(fā)育的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，如促進(jìn)休眠、促進(jìn)氣孔關(guān)閉、抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)離層的形成進(jìn)而引起器官脫落等；ABA也可作為觸發(fā)植物對(duì)逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)的傳遞體，參與調(diào)控植物對(duì)逆境脅迫，如干旱、高鹽、低溫等產(chǎn)生的應(yīng)答。業(yè)已證明，脫落酸（abscisic acid，ABA）是傳遞脅迫信息（如鹽脅迫等）的重要信使，能夠增強(qiáng)植物體對(duì)多種逆境的抵抗能力。有報(bào)道表明受到較嚴(yán)重的水分脅迫時(shí)，不僅在田間葡萄各營(yíng)養(yǎng)器官中均發(fā)現(xiàn)ABA的積累，而且在“全球紅