基于核酸適配體熒光法檢測赭曲霉素A

1、wyiT論女第表&?；诤怂徇m配體熒光法檢測赭曲霉素 A【摘要】：第一章：簡單介紹了核酸適配體的定義和特點，赭曲霉素A(OTA)檢測的重要性和常用的檢測方法；綜述了基于核酸適配體檢 測赭曲霉素A的不同方法；闡述了本論文的立題背景、研究內容及 創(chuàng)新點。第二章：利用核酸適配體熒光探針，基于熒光共振能量轉移原理建立了一種檢測赭曲霉素 A的熒光分析方法。赭曲霉素 A在 375nm波長下激發(fā)，在430nm處可以發(fā)熒光，赭曲霉素A與標記有熒光 素的核酸適配體結合后，兩者之間可發(fā)生熒光共振能量轉移，熒光素在 518nm處的熒光強度增強。根據(jù) 518nm處熒光強度的變化可實現(xiàn)對 赭曲霉素A的檢測。這種

2、檢測方法簡單、快速、特異性強，檢出限達 到了 1nmol/L。第三章：利用熒光素標記的核酸適配體(FDNA)和熒光 猝滅基團(BHQ)標記的互補寡聚核苷酸鏈(QDNA)建立了一種檢測赭 曲霉素A的熒光分析法。未加入赭曲霉素 A時,標記有熒光素的核酸 適配體與標記有猝滅基團的互補寡聚核苷酸鏈結合，熒光基團與猝滅 基團靠近，導致熒光猝滅；當加入赭曲霉素 A后,FDNA與赭曲霉素A 高親和力高特異性結合，熒光基團與猝滅基團遠離,FDNA的熒光信號 得到恢復。根據(jù)FDNA與目標物結合前后熒光強度的變化，可以實現(xiàn) 對赭曲霉素A的定量檢測。第四章：利用赭曲霉素 A本身的熒光特 性，發(fā)展了一種通過熒光各向異

3、性分析快速考察赭曲霉素A(OTA)與核酸適配體之間的相互作用的方法。赭曲霉素A與核酸適配體的特異性結合使分子體積增大，赭曲霉素A旋轉變慢，引起熒光各向異性值增大。通過熒光各向異性分析考察了緩沖液成分中金屬離子對適配體 親和力的影響，結果發(fā)現(xiàn)當Na+與Ca2+同時存在時赭曲霉素A與核酸 適配體之間的親和力明顯增強，這與溶液中只有Ca2+時相比親和力增 大了 18倍，當Ca2+不存在時適配體親和力完全消失。另外，利用熒光 各向異性方法研究了核酸適配體突變對親和力的影響，對適配體親和力起重要作用的堿基可以被鑒別出。建立了一種基于適配體檢測 OTA 的熒光各向異性分析法，在緩沖液中固定適配體和OTA標

4、準物的濃度, 加入不同濃度的OTA待測物,OTA熒光各向異性值會隨著待測物濃度 的增加而降低，根據(jù)熒光各向異性值的變化可以實現(xiàn)對 OTA的檢測。 第五章：建立了一種采用單熒光基團標記的核酸適配體檢測赭曲霉素 A的方法。當標記有熒光基團的適配體與 OTA結合時,熒光基團周圍 的環(huán)境發(fā)生變化，從而引起熒光強度的變化，根據(jù)熒光強度的變化實現(xiàn) 對OTA的檢測?？疾炝诉m配體不同位點上標記熒光素（包括T堿基,3' 端,5'端）對適配體親和力的影響，還考察了熒光素標記的適配體對 OTA的響應性能。一些熒光素標記的核酸適配體在檢測OTA時表現(xiàn)出信號增加或是降低的響應。采用熒光開關適配體，實現(xiàn)了

5、對OTA的 快速、有選擇性的檢測，在稀釋后的紅葡萄酒中也可以檢測 OTA,表明 本方法可以實現(xiàn)復雜基質中 OTA的檢測。【關鍵詞】：核酸適配體赭 曲霉素A熒光分析熒光各向異性【學位授予單位】：山西大學【學位級別】：碩士【學位授予年份】：2013【分類號】：0657.3【目錄】:中文摘要10-12ABSTRACT12-14第一章緒論14-341.1引言14- 151.2赭曲霉素A檢測方法研究進展15-251.2.1核酸適配體介紹15- 161.2.2基于核酸適配體的赭曲霉素 A的檢測16-251.2.2.1基于核酸適配體光學方法檢測赭曲霉素A16-191.2.2.2基于核酸適配體電化學方法檢測赭

6、曲霉素 A19-241.2.2.3基于核酸適配體檢測赭曲霉素A的其他方法24-251.3立題背景及主要研究內容25-261.4創(chuàng)新點26-27 參考文獻27-34第二章基于熒光共振能量轉移的核酸適配體探針檢測赭曲霉素A34-462.1引言34-352.2實驗部分35-362.2.1儀器與試劑 352.2.2熒光分析352.2.3實驗條件的優(yōu)化35-362.2.4赭曲霉素A的檢 測362.2.5特異性實驗362.2.6回收率實驗362.3結果與討論36-422.3.1 實驗原理36-372.3.2赭曲霉素A與FAM標記的適配體之間的FRET 考察372.3.3離子濃度的影響37-392.3.4方

7、法選擇性的考察39-402.3.5 赭曲霉素A的檢測40-412.3.6紅葡萄酒樣品中赭曲霉素 A的檢測 41-422.4結論42參考文獻42-46第三章基于結構轉換適配體熒光法 檢測赭曲霉素A46-583.1引言46-473.2實驗部分47-483.2.1儀器和試 劑473.2.2熒光分析473.2.3實驗條件的優(yōu)化47-483.2.4赭曲霉素A的 檢測483.2.5特異性實驗 483.2.6回收率實驗 483.3結果與討論48- 553.3.1實驗原理48-493.3.2離子濃度、pH值、Tween20的影響49- 513.3.3試劑加入順序及溫育溫度的影響51-523.3.4選擇性的考察

8、yiT論女為表站家52-53335赭曲霉素A的檢測53-543 36復雜基質中赭曲霉素 A的檢 測54-553.4結論55參考文獻55-58第四章利用熒光各向異性分析研 究赭曲霉素 A與適配體之間的相互作用及對赭曲霉素A的檢測58-804.1引言58-594.2實驗部分59-60421儀器和試劑594.2.2實驗 方法59-604.2.3解離常數(shù)的測定604.3結果與討論60-754.3.1赭曲霉 素A與適配體之間相互作用的熒光各向異性分析60-624.3.2陽離子對適配體親和力的影響 62-644.3.3緩沖液pH對適配體親和力的影響 64-654.3.4解離常數(shù)的測定65-694.3.4.1親和力的測定654.3.4.2解離 常數(shù)的測定65-664.3.4.3不同緩沖液中解離常數(shù)的考察 66-694.3.5適 配體堿基突變對親和力的影響69-724.3.6采用熒光各向異性法檢測赭 曲霉素A72-754.3.6.1熒光各向異性法檢測赭曲霉素 A72-734.3.6.2復 雜基質中赭曲霉素A的檢測73-754.4結論75-76參考文獻76-80第五 章利用單熒光基團標記的核酸適配體檢測赭曲霉素A80-945.1引言805.2實驗部分80-825.2.1儀器和試劑80-815.2.2熒光分析81-825.3 結果與討論82-895.3.1實驗原理 825.3.2適配體標記位點的篩選