瓊脂糖凝膠電泳目的及后續(xù)工作

1、；瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。1. 分離純化大片段DNA 瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。分離后如需回收：將需要的DNA膠部分切下，盡量不要切到多余的膠。切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。2. 提取大分子DNA 構(gòu)建大片段基因組文庫

2、的關(guān)鍵就是獲得高分子量的基因組DNA。而利用成熟的商品化試劑盒提取基因組DNA只能得到大小約在20kb左右的DNA;酶抽提法需經(jīng)過多次抽提法才能得到較純的DNA，但極易造成基因組斷裂，也難以得到大于300kb的基因組DNA。兩種方法均不能達(dá)到目的，但經(jīng)過研究人員不懈的研究，利用瓊脂糖凝膠制備成凝膠塊提取基因組DNA能夠獲得足夠大的DNA片段，可以完全符合構(gòu)建粘?；蚪M文庫的要求。在此過程中研究人員在用低熔點瓊脂糖還是普通熔點瓊脂糖制備凝膠塊的問題中選擇了后者，因為低熔點瓊脂糖價格昂貴且膠塊在制備純化的過程中容易斷裂，而普通熔點瓊脂糖與低熔點瓊脂糖在基因組DNA制備方面沒有區(qū)別。3. PCR產(chǎn)物

3、檢測 在基因組DNA的提取中，DNA經(jīng)孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗滌2次，再適量的雙蒸水溶解DNA。然后在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以1kb DNA ladder 為參照，估計DNA溶液濃度。具體檢驗方法是:2.0%瓊脂糖制成凝膠，取6 微升 AFLP-PCR產(chǎn)物與1微升上樣緩沖液混勻后上樣，用1×TBE電泳緩沖液，120V電泳50min，使用EB溶液染色后在凝膠成像系統(tǒng)(ChampGel-3200)上觀察拍照。4. 免疫擴(kuò)散法中的應(yīng)用 免疫擴(kuò)散法是指抗原與抗體在同一凝膠中擴(kuò)散的方法，是觀察可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)和抗原抗體鑒定的最基本方法之一。利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)，

4、使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉淀帶?？乖贵w復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性的半滲透性屏障，它可以阻止免疫學(xué)性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴(kuò)散，這樣由不同抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)。 利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)(分子量自十幾萬到幾百萬以上)自由通過。因為大多數(shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴(kuò)散。而且瓊脂糖

5、凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優(yōu)點，因此是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴(kuò)散介質(zhì)。 雙向瓊脂擴(kuò)散實驗中也用瓊脂或瓊脂糖作為擴(kuò)散介質(zhì)，原因同上。5. 瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法 在生物技術(shù)實驗中，PCR反應(yīng)獲得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列， 分子雜交中所制備的探針等，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段與其它DNA分開， 這就需要有一套方法將目的DNA從凝膠中分離出來，通過處理后得到純化的目的DNA， 以用于以后分子雜交，重組子構(gòu)建，序列分析等。柱回收試劑盒：目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解Buffer徹底溶解，上包埋

6、有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實驗。這個方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目前最多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個方法不適合用于大片斷的回收。 玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒：這個方法比前面的方法更為靈活，可以根據(jù)每次回收實驗時預(yù)期回收量來調(diào)整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載量，也不會造成浪費。前面的操作步驟和上者一樣，將電泳凝膠的條帶切下，Buffer溶解，加入純化填料填料吸附混合，快速離心沉淀去上清，洗滌沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脫液純化介質(zhì)中吸附的片斷釋放出來，離心，取上清，就是回

7、收的產(chǎn)物。這個方法適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收，但是操作就較前者復(fù)雜一些。低熔點瓊脂糖：傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。 透析帶電洗脫法。切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中再電泳一段時間，讓DNA 走出凝膠，走向溶液中，再反向電泳一會兒，將附在透析帶上的DNA 趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀，那塊膠通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶非常難搞，只有在萬不得已的非常大的片斷時才會考慮的。也是丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。

8、0; DEAE纖維素膜紙片法和其他改良法。早期實驗室最常用方法之一。將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA 被膜片截留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA 了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個方法不適合做較大的DNA ，因為洗脫比較困難.6. Northern blot 和Southern blot的第一步Northern blot （諾瑟雜交）是一種通過檢測RNA的表達(dá)水平來檢測基因表達(dá)的方法，通過Northern blot的方法可以檢測到細(xì)胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。而Southern blot 是一種常用的 DNA 定量的方法。這兩種方法首先都要將DNA用凝膠電泳分離找出目的片段，再將目的片段轉(zhuǎn)到固體膜上進(jìn)行檢測。Southern blot原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在