核酸提取及常見問題分析OK課件

1、核酸提取及常見問題分析核酸提取及常見問題分析第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作基

2、本的操作 。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介q 基因組基因組DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非基因組非基因組DNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取 堿裂解法堿裂解法 煮沸法煮沸法線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取 差速離心結(jié)合差速離心結(jié)合SDS

3、裂解法裂解法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取經(jīng)典方法）提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化銨），是一種溴化銨），是一種陽離子去污劑陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。出來。注：注：CTAB溶液在低于溶液在

4、低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。qCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNa

5、se活性；活性；NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除qCTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前

6、加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。和多糖結(jié)合，有效去除多糖。qCTAB法流程圖法流程圖植物材料植物材料裂解液裂解液上層溶液上層溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS法原理法原理SDS是一種是一種陰離子去垢劑陰離子去垢劑，在高溫（，在高溫（5565）條件下能裂解細(xì)）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析

7、，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取緩沖液提取緩沖液q SDS SDS法流程圖法流程圖 （以動(dòng)物組織為例）（以動(dòng)物組織為例） 動(dòng)

8、物組織動(dòng)物組織細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法超聲波法、研磨法、凍融法 化學(xué)方式化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法q根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫?？?/p>

9、捷高效?？旖莞咝?。低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。物，從而達(dá)到分離目的。濃鹽法濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各

10、種內(nèi)容物q堿裂解法原理堿裂解法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理當(dāng)用堿處理DNADNA溶液時(shí)，線狀染色體溶液時(shí)，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNAD

11、NA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體對(duì)數(shù)期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液q煮沸法原理煮沸法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處理當(dāng)加熱處理DNADNA溶液時(shí)，線狀染色體溶液時(shí)，

12、線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。q差速離心法原理差速離心法原理 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)將待分離物質(zhì)置于均勻

13、介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來。種組分分級(jí)分離出來。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常

14、見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策I.I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料

15、，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組提取血液基因組DNA時(shí)，要時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成否則會(huì)造成DNA降解降解含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較含量較少，提取前先富集少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷

16、貝的質(zhì)粒，如為盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧厌槍?duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：解預(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DN

17、ADNA的提取的提取菌體量適當(dāng)菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（5分鐘），分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組有基因組DNA的污染的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁用酶法或機(jī)械法處理，以破壁采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)

18、作要輕柔要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法去雜質(zhì)的方法基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl5M N

19、aCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚

20、類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入沉淀時(shí)加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有

21、利于充分沉淀充分沉淀沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNasepH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)后續(xù)酶

22、解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數(shù)（次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：?jiǎn)栴}一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)?duì)策策材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源

23、核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二：?jiǎn)栴}二：DNADNA降解。降解。對(duì)對(duì)策策 原

24、原因因?qū)嶒?yàn)材料不佳或量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗滌時(shí)洗滌時(shí)DNADNA丟失丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加加PKPK的用量）的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問題三：?jiǎn)栴}三

25、：DNADNA提取量少。提取量少。對(duì)對(duì)策策 原原因因第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；性，核酸

26、釋放；釋放出來的釋放出來的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNARNA。 q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步驟步驟: :材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。盡量新鮮。裂解變性裂解變性：異硫氰酸胍異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNARNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制

27、核酸酶。純化分離：純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除雜物。氯仿可抽提去除雜物。洗滌：洗滌：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：異丙醇、無水乙醇。異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（乙酸鈉（pH4.0pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNARNA。q 材料材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧先缛舨牧蟻碓蠢щy，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在貯存在TRIzol

28、TRIzol或樣品貯存液中，于或樣品貯存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，液氮長(zhǎng)期保存，7070短期保存短期保存q 樣品破碎及裂解樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加裂解液裂解通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：酵母和細(xì)菌：一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快先液氮研磨和勻漿，后加

29、裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少為減少DNADNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量q 純化：純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的純化方法，如經(jīng)典的純化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易造成易造成 RNA RNA 降解；降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA RNA 后續(xù)酶反后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前

30、較為理想的選擇。應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對(duì)策原因分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對(duì)策問題、原因分析及其對(duì)策q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實(shí)

31、驗(yàn)效果不佳下游實(shí)驗(yàn)效果不佳q 新鮮細(xì)胞或組織：新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量裂解液的質(zhì)量 外源外源RNaseRNase的污染的污染 裂解液的用量不足裂解液的用量不足 組織裂解不充分組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 ( (如脾臟，胸腺等如脾臟，胸腺等) )，很，很難避免難避免 RNA RNA 的降解。的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液多裂解液。q 冷凍樣品：冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70-70冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)

32、；冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 蛋白質(zhì)污染：蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉

33、淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚殘留：苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 抽提試劑殘留：抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 RNARNA，并且徹底去掉，并且徹底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。解決辦法解決辦法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 設(shè)備限制：設(shè)備限制：測(cè)定測(cè)定

34、OD260 OD260 及及OD280 OD280 數(shù)值時(shí)，要使數(shù)值時(shí)，要使OD260 OD260 讀數(shù)在讀數(shù)在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。之間。此范圍線性最好。q 用水稀釋樣品：用水稀釋樣品：測(cè)測(cè) OD OD 時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用 10 mM Tris10 mM Tris，pH 7.5pH 7.5。用。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。 q 非變性電泳：非變性電泳： 上樣量超過上樣量超過 3ug，電壓超過，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致均可能導(dǎo)致 28S

35、和和 18S 條帶分不開。條帶分不開。q 變性電泳條帶變淡：變性電泳條帶變淡： EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；變性電泳比非變性電泳要淡一些； 甲醛的質(zhì)量不高甲醛的質(zhì)量不高 。q RNA RNA 降解降解 q 抽提試劑的殘留抽提試劑的殘留 75% 75% 乙醇洗滌乙醇洗滌 q 樣品中雜質(zhì)的殘留樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA RTRT常見問題分析和解決方案常見問題分析和解決方案問題一：?jiǎn)栴}一：少量或沒有少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物產(chǎn)物RNARNA降解降解分離無污染，高質(zhì)量的分離無污染，高質(zhì)量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制劑沉淀，