細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的系統(tǒng)生物技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁(yè)，共57頁(yè)。生物制藥與現(xiàn)代生物制藥與現(xiàn)代(xindi)中藥工程中藥工程 第1頁(yè)/共57頁(yè)第二頁(yè)，共57頁(yè)。第2頁(yè)/共57頁(yè)第三頁(yè)，共57頁(yè)。概述(i sh)1958,美國(guó)NCI開始篩選新型(xnxng)抗腫瘤藥物研究計(jì)劃; 美國(guó)化學(xué)家Wani和Wall于1971年從太平洋紅豆杉樹皮中提取到一種抗腫瘤物質(zhì)紫杉醇。紫杉醇的發(fā)現(xiàn)紫杉醇的發(fā)現(xiàn)(fxin)第3頁(yè)/共57頁(yè)第四頁(yè)，共57頁(yè)。與微管蛋白 N 端第31位、217 231位氨基酸結(jié)合，抑制微管解聚，抑制有絲分裂(yu s fn li)，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,使癌細(xì)胞死亡。紫杉醇作用紫杉醇作用(zuyng)機(jī)理機(jī)理:概述(i s

2、h)(1979(1979年年) )第4頁(yè)/共57頁(yè)第五頁(yè)，共57頁(yè)。概述(i sh)19921992年年FDAFDA批準(zhǔn)批準(zhǔn)(p zhn)(p zhn)紫杉醇紫杉醇20062006年年FDAFDA批準(zhǔn)批準(zhǔn)(p zhn)(p zhn)多烯紫杉多烯紫杉醇醇晚期乳腺癌, 晚期非小細(xì)胞肺癌(fi i)晚期卵巢癌, 胰腺癌、頭頸癌胃癌,前列腺癌第5頁(yè)/共57頁(yè)第六頁(yè)，共57頁(yè)。OCH3COOOHOHOOC6H5COOC6H5OOHC6H5CONHCH3COO321101372概述(i sh)紫杉醇與多烯紫杉醇紫杉醇與多烯紫杉醇H(CH3)3CO第6頁(yè)/共57頁(yè)第七頁(yè)，共57頁(yè)。1)1)天然天然(tinr

3、n)(tinrn)紅豆杉植紅豆杉植物提取法物提取法概述(i sh)第7頁(yè)/共57頁(yè)第八頁(yè)，共57頁(yè)。2) 化學(xué)化學(xué)(huxu)全合全合成成(2) Nicoloau路線路線-會(huì)聚式會(huì)聚式 A環(huán)和環(huán)和C環(huán)環(huán) 八元八元B環(huán)，得到環(huán)，得到ABC三環(huán)化合物。三環(huán)化合物。(3) Danishefsky路線路線-會(huì)聚式會(huì)聚式 D環(huán)環(huán)與與A和和C、D環(huán)片段環(huán)片段(pin dun)連接，合成連接，合成八元八元B環(huán)。環(huán)。(1) Holton路線路線(lxin)-線線性途徑性途徑(2) AABABC。HOCH3COOOHOHOOC6H5COOROBCAD第8頁(yè)/共57頁(yè)第九頁(yè)，共57頁(yè)。(2R,3S)-3-N-苯甲

4、?；郊柞；? 苯基苯基(bn j)異絲氨酸異絲氨酸避免了合成避免了合成(hchng)紫杉醇復(fù)雜的母環(huán)部紫杉醇復(fù)雜的母環(huán)部分分321OHC6H5OOHC6H5CONH母核：紅豆杉針葉中提取母核：紅豆杉針葉中提取巴卡亭巴卡亭 III（R=Ac）或或10-去乙?；涂ㄍとヒ阴；涂ㄍ?III（10-DAB，R=H）HOCH3COOOHOHOOC6H5COORO110137第9頁(yè)/共57頁(yè)第十頁(yè)，共57頁(yè)。 紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng) 2004年年6月月28日，日，Bristol-Myers Squibb 獲總統(tǒng)綠色化獲總統(tǒng)綠色化學(xué)學(xué)(huxu)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。4)生物工程生物工程(shn w n

5、 chn)方方法法概述(i sh)第10頁(yè)/共57頁(yè)第十一頁(yè)，共57頁(yè)。第11頁(yè)/共57頁(yè)第十二頁(yè)，共57頁(yè)。形態(tài)變化形態(tài)變化:細(xì)胞細(xì)胞(xbo)分化與紫分化與紫杉醇生產(chǎn)細(xì)胞杉醇生產(chǎn)細(xì)胞(xbo)應(yīng)答機(jī)理應(yīng)答機(jī)理: 活性氧迸發(fā)刺激紫杉醇合成活性氧迸發(fā)刺激紫杉醇合成,同同時(shí)引起細(xì)胞時(shí)引起細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡微環(huán)境微環(huán)境(hunjng)剪切力場(chǎng)剪切力場(chǎng)現(xiàn)象現(xiàn)象(xinxing)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵問題第12頁(yè)/共57頁(yè)第十三頁(yè)，共57頁(yè)。系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)生物技術(shù)生物技術(shù)DNADatabasesCompare, cluster, integrateNew Theory: structure and f

6、unctionNew Application: industrial process improvement數(shù)據(jù)有待積累數(shù)據(jù)有待積累理論有待建立理論有待建立最終最終(zu zhn)必將必將突破突破第13頁(yè)/共57頁(yè)第十四頁(yè)，共57頁(yè)?；蚪M基因組+ +轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(zhun l)(zhun l)組回答為什么組回答為什么? WHY? WHY蛋白質(zhì)組回答蛋白質(zhì)組回答(hud)(hud)如何進(jìn)行如何進(jìn)行? HOW? HOW代謝組回答是什么代謝組回答是什么? WHAT? WHAT回答工業(yè)過程的三個(gè)基本問題回答工業(yè)過程的三個(gè)基本問題第14頁(yè)/共57頁(yè)第十五頁(yè)，共57頁(yè)。ProteomicsMetabolom

7、icsLipidomics第15頁(yè)/共57頁(yè)第十六頁(yè)，共57頁(yè)。微環(huán)境(hunjng):固定化: 15mmh: 15mm固定化提高固定化提高(t go)了紫杉醇的產(chǎn)量了紫杉醇的產(chǎn)量第16頁(yè)/共57頁(yè)第十七頁(yè)，共57頁(yè)。固定化不同區(qū)域的細(xì)胞固定化不同區(qū)域的細(xì)胞(xbo)活性與產(chǎn)量的活性與產(chǎn)量的關(guān)系關(guān)系紫杉醇合成活力：由外層到核心(hxn)增加細(xì)胞活力：由外層到核心(hxn)降低第17頁(yè)/共57頁(yè)第十八頁(yè)，共57頁(yè)。固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(xbo)出現(xiàn)分化：出現(xiàn)分化：AGPs 表達(dá)表達(dá)Susp.Immob.Cheng JS, Lei C, Wu JC, Yuan YJ*. Journal of Bi

8、otechnology, 2008, 133(1): 96-102. 第18頁(yè)/共57頁(yè)第十九頁(yè)，共57頁(yè)。Susp.Immob.ERK-like 磷酸化固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(xbo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控調(diào)控Cheng JS, Yin DM, Yuan YJ*. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(6): 1250-1257第19頁(yè)/共57頁(yè)第二十頁(yè)，共57頁(yè)。固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(xbo)對(duì)對(duì)MAP like-Kinases 磷酸化響應(yīng)及磷酸化響應(yīng)及調(diào)控作用調(diào)控作用Cheng JS, Yuan YJ*. Biotechnology an

9、d Applied Biochemistry, 2006, 44: 109-117 第20頁(yè)/共57頁(yè)第二十一頁(yè)，共57頁(yè)。Cheng JS, Yuan YJ. Proteomics 2006, 6, 2199-2007 2-DE2-DE和和MSMS，細(xì)胞生長(zhǎng)、生產(chǎn)，細(xì)胞生長(zhǎng)、生產(chǎn)(shngchn)(shngchn)與固定化微環(huán)境作用的關(guān)系蛋白質(zhì)組。與固定化微環(huán)境作用的關(guān)系蛋白質(zhì)組。發(fā)現(xiàn)氮、硫和糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞分裂和次代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)氮、硫和糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞分裂和次代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系為細(xì)胞培養(yǎng)方式選擇提供依據(jù)為細(xì)胞培養(yǎng)方式選擇提供依據(jù)蛋白組分析方法揭示固定化細(xì)胞蛋白組分析

10、方法揭示固定化細(xì)胞(xbo)時(shí)空異質(zhì)時(shí)空異質(zhì)性性第21頁(yè)/共57頁(yè)第二十二頁(yè)，共57頁(yè)。Oxidative response of cells induced by shear stressHistochemical detection of H2O2 in cells by DAB staining Cell death was evaluated by Evans Blue staining 第22頁(yè)/共57頁(yè)第二十三頁(yè)，共57頁(yè)。Changes of four identified proteins in media based on 2-D 第23頁(yè)/共57頁(yè)第二十四頁(yè)，共57頁(yè)。Fu

11、nctional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS 第24頁(yè)/共57頁(yè)第二十五頁(yè)，共57頁(yè)。Functional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS J-S Cheng, Y-J Yuan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009, 58:8492 第25頁(yè)/共57頁(yè)第二十六頁(yè)，共57頁(yè)。Metabolite profiling of Taxus cells in response to shear str

12、ess by GC-TOF-MS 第26頁(yè)/共57頁(yè)第二十七頁(yè)，共57頁(yè)。Total ion chromatograms of Taxus cells for GC-MS analysis.P-P Han and Y-J Yuan. Biotechnology Progress. doi: 10.1002/btpr.209第27頁(yè)/共57頁(yè)第二十八頁(yè)，共57頁(yè)。(B) Loading plot generated from PCA analysis. (D) VIP plot from PLS analysis. Multivariate analysis by PCA and PLS.Sco

13、re plots from PCA (A) and PLS (C).第28頁(yè)/共57頁(yè)第二十九頁(yè)，共57頁(yè)。Variations of intracellular metabolites under shear stress. A total of 65 intracellular metabolites第29頁(yè)/共57頁(yè)第三十頁(yè)，共57頁(yè)。Mmetabolite abundance onto the metabolic network.Shear stress inhibiting TCA cycle and N metabolism. Co-induction of glycolysis

14、and accumulation of compatible solutes第30頁(yè)/共57頁(yè)第三十一頁(yè)，共57頁(yè)。(a)(a)得分得分(d fn)(d fn)圖圖(b)(b)載荷載荷(zi h)(zi h)圖圖PCAPCA分析正常分析正常(zhngchng)(zhngchng)細(xì)胞和細(xì)胞和不同誘導(dǎo)子脅迫的誘導(dǎo)不同誘導(dǎo)子脅迫的誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞MeJA和和Ce4+誘導(dǎo)東北紅豆杉細(xì)胞磷脂酶的差異激活及下誘導(dǎo)東北紅豆杉細(xì)胞磷脂酶的差異激活及下游脂質(zhì)信號(hào)分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型游脂質(zhì)信號(hào)分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型0.00.40.81.21.612 h24 h050100150200250 Ce4+ (JA) Ce4+

15、+ EYTA (JA) LysoPC (nmol mg-1 DW) JA (ng g-1 FW) Ce4+ (LysoPC) Ce4+ + EYTA (LysoPC) 010203040048121620 Taxol ( g g-1 DW) Taxol Ce4+Control ApoptosisApoptotic ratio (%)ControlCe4+Ce4+EYTACe4+EYTAYang S, Lu SH, Yuan YJ. BBA-Mol. Cell Biol. L.1781 (2008) 123134 IF:3.539誘導(dǎo)子作用下紅豆杉細(xì)胞膜磷脂代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)子作用下紅豆杉細(xì)胞膜磷

16、脂代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)第31頁(yè)/共57頁(yè)第三十二頁(yè)，共57頁(yè)。Phospholipidomics of Taxus cells responsing to shear stress第32頁(yè)/共57頁(yè)第三十三頁(yè)，共57頁(yè)。Negative-ion LC/ESI/MS base peak chromatogram of phospholipids from Taxus cells 40 h after shear stress treatment. PG, phosphatidylglycerol; PE, phosphatidylethanolamine; PC, phosphatidylcholine

17、; LysoPC, lysophosphatidylcholine. PA, phosphatidic acid; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine;第33頁(yè)/共57頁(yè)第三十四頁(yè)，共57頁(yè)。Phospholipid contents in shear stress-induced Taxus cells. 第34頁(yè)/共57頁(yè)第三十五頁(yè)，共57頁(yè)。Score plots from PCA (A) and PLS (C). (B) Loading plot from PCA. (D) VIP plot from PLS. Multiv

18、ariate analysis by PCA and PLS.第35頁(yè)/共57頁(yè)第三十六頁(yè)，共57頁(yè)。LysoPC Changes of biomarker phospholipidsPAP-P Han and Y-J Yuan. FASEB J. 2009 23: 623-630. 第36頁(yè)/共57頁(yè)第三十七頁(yè)，共57頁(yè)。Activation of phospholipase D Activation of phospholipase CDefining the enzymatic source of PA.第37頁(yè)/共57頁(yè)第三十八頁(yè)，共57頁(yè)。Analysis of lipidomics

19、 of Taxus cells in response to shear stress第38頁(yè)/共57頁(yè)第三十九頁(yè)，共57頁(yè)。Phospholipid contents in shear stress-induced T. cells. Decrease total phospholipids,Structural phospholipids such as PG, PE, and PC第39頁(yè)/共57頁(yè)第四十頁(yè)，共57頁(yè)。Sterols profiles of T. cells第40頁(yè)/共57頁(yè)第四十一頁(yè)，共57頁(yè)。Fatty acids profiles in T. cells第41頁(yè)/共

20、57頁(yè)第四十二頁(yè)，共57頁(yè)。Variations of fatty acids under shear stress. Increase very-long-chain saturated FAIncrease monounsaturated FADecrease short chain saturated FA第42頁(yè)/共57頁(yè)第四十三頁(yè)，共57頁(yè)。Schematic changes of sterol abundance onto the plant sterol biosynthetic pathway. 第43頁(yè)/共57頁(yè)第四十四頁(yè)，共57頁(yè)。The ratios of campest

21、erol: sitosterol, stigmasterol: sitosterol, and stigmasterol: campesterol in shear stress-induced T. cells. vIncrease stigmasterol at the expense of sitosterol and campesterol第44頁(yè)/共57頁(yè)第四十五頁(yè)，共57頁(yè)。The ratios between sterols and phospholipids in shear stress-induced T. cells. P-P Han, J Zhou, Y-J Yuan. Biotechnology and Applied Biochemistry doi:10.1042/BA20090102第45頁(yè)/共57頁(yè)第四十六頁(yè)，共57頁(yè)。合成(hchng)生物學(xué)第46頁(yè)/共57頁(yè)第四十七頁(yè)，共57頁(yè)。第47頁(yè)/共57頁(yè)第四十八頁(yè)，共57頁(yè)。第48頁(yè)/共57頁(yè)第四十九頁(yè)，共57頁(yè)。第49頁(yè)/共57頁(yè)第五十頁(yè)，共57頁(yè)。第50頁(yè)/共57頁(yè)第五十一頁(yè)，共57頁(yè)。Nature Biotechnology 21, 796 - 802 (2003) by Jay D Keasling