還原糖的測定方法

1、還原糖的測定方法一、高錳酸鉀滴定法1. 原理 樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，其中還原糖在堿性環(huán)境下將銅鹽還原為氧化亞銅，加硫 酸鐵后，氧化亞銅被氧化為銅鹽，以高錳酸鉀溶液滴定氧化作用后生成的亞鐵鹽， 根據(jù)高錳酸鉀消耗量計(jì)算氧化亞同含量，再查表得還原糖量。 2. 適用范圍GB5009.7-85，本法適用于所有食品中還原糖的測定以及通過酸水解或酶水解 轉(zhuǎn)化成還原糖的非還原性糖類物質(zhì)的測定。3. 儀器(1) 滴定管25ml古氏坩堝或G4垂融坩堝(3) 真空泵(4) 水浴鍋4. 試劑除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。4.1 6 mol/L 鹽酸：量取50ml鹽酸加水稀釋至100 ml。4.2甲基紅指

2、示劑：稱取10mg甲基紅，用100ml乙醇溶解。4.3 5 mol/L 氫氧 化鈉溶液:稱取20g氫氧化鈉加水溶解并稀釋至100ml。4.4堿性酒石酸銅甲液： 稱取34.639g硫酸銅(CuSO4?5H2Q)加適量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀釋至 500ml，用精制石棉過濾。4.5堿性酒石酸銅乙液：稱取173g酒石酸鉀鈉與50g氫氧化鈉，加適量水溶 解，并稀釋至500ml，用精制石棉過濾，貯存于橡膠塞玻璃瓶中。4.6精制石棉：取石棉先用 3mol/L 鹽酸浸泡 2,3 天，用水洗凈，再加 2.5mol/L 氫氧化鈉溶液浸泡2,3 天，傾去溶液，再用熱堿性酒石酸銅已液浸泡數(shù)小時(shí)，用水洗凈。

3、再以 3mol/L 鹽酸浸泡數(shù)小時(shí)，以水洗至不呈酸性。然后加水振搖，使成微細(xì)的漿狀軟縣委，用 水浸泡并貯存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩堝用。 4.7 0.1000mol/L 高錳酸 鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取3.3g高錳酸鉀，溶于1050 ml水中，緩緩煮沸15min,冷卻， 于暗處放置兩周，用已處理過的玻璃濾鍋過濾，貯存于棕色瓶中（ 注: 玻璃濾鍋的處理是指玻璃濾鍋在同樣濃度的高錳酸鉀中溶液緩緩煮沸 5min）標(biāo)定: 準(zhǔn)確稱取 0.150.2 克（準(zhǔn)至 0.001 克）草酸鈉，放入 250ml 的錐形瓶內(nèi)， 加 80ml 水和 20ml 硫酸溶液 （1+4） ，加熱到 7585?，然后以待標(biāo)定的高錳

4、酸鉀溶液 滴定，近終點(diǎn)時(shí)，保持液溫在 60-70?, 繼續(xù)滴至溶液所呈現(xiàn)的粉紅色保持 30 秒不 消失即為終點(diǎn)，同時(shí)作空白。計(jì)算:C（1/5KMnO4）=M草酸鈉）/（V-V 空白）X 0.067M 草酸鈉的質(zhì)量 gV-V 空白 高錳酸鉀溶液用量 ml0.067 草酸鈉的毫摩爾質(zhì)量 g/mol注: 草酸鈉 : 在 1 0 5, 1 1 0?烘至恒重，置于干燥器中冷卻至室溫。4.8 1mol/L 氫氧化鈉溶液 : 稱取 4g 氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至 100ml。 4.9 硫酸鐵溶液 : 稱取 50g 硫酸鐵，加入 200ml 水溶解后，慢慢加入 100ml 硫酸，冷卻 后加水稀釋至 1L。4

5、.10 3mol/L 鹽酸: 量取 30ml 鹽酸，加水稀釋至 120ml。5. 操作方法5.1 樣品處理 :5.1.1 乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品 : 稱取約 0.5,2 g 固體樣品 （吸取 2,10ml 液體樣品 ） ，置于 250 ml 容量瓶中，加 50ml 水，搖勻。加入 10 ml 堿性酒石酸 銅甲液及4ml1mol/L氫氧化鈉溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min,用干燥濾紙 過濾，棄去初濾液，濾液備用。 （注:此步驟目的是沉淀蛋白 ） 5.1.2 酒精性飲料 : 吸取 100 ml 樣品，置于蒸發(fā)皿中，用 1mol/L 氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上 蒸發(fā)至原體積1/4后

6、（注:如果蒸發(fā)時(shí)間過長，應(yīng)注意保持溶液 pH為中性），移入 250ml容量瓶中。加50 ml水，混勻。以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液 " 起依法操作。5.1.3 含多量淀粉的食品 :稱取 2,10 g 樣品，置于 250 ml 容量瓶中，加 200 ml水，在45?水浴中加熱1h，并時(shí)時(shí)振搖。（注意:此步驟是使還原糖溶于水中， 切忌溫度過高，因?yàn)榈矸墼诟邷貤l件下可糊化、水解，影響檢測結(jié)果。 ）冷卻后加 水至刻度，混勻，靜置。吸取 200ml 上清液于另一 250 ml 容量瓶中，以下按 5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作

7、。5.1.4 含有脂肪的食品 : 稱取 2,10g 樣品，先用乙醚或石油醚淋洗 3次，去除 醚層。加入50ml水混勻，以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操 作。5.1.5 汽水等含有二氧化碳的飲料 : 吸取 100 ml 樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上 除去二氧化碳后，移入 250ml 容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中， 再加水至刻度，混勻后，備用。5.2 樣品測定 :吸取50ml處理后的樣品溶液，于400ml燒杯中，加入25ml堿性酒石酸銅甲液 及 25ml 乙液，于燒杯上蓋一表面皿，加熱，控制在 4min 內(nèi)沸騰，再準(zhǔn)確煮沸 2min,乘熱用

8、鋪好石棉的古氏坩堝或 G4垂融坩堝抽濾，并用60?熱水洗滌燒杯及 沉淀，至洗液不成堿性為止。 （注: 還原糖與堿性酒石酸銅試劑的反應(yīng)一定要在沸騰 狀態(tài)下進(jìn)行，沸騰時(shí)間需嚴(yán)格控制。煮沸的溶液應(yīng)保持藍(lán)色，如果藍(lán)色消失，說明 還原糖含量過高，應(yīng)將樣品溶液稀釋后重做。 ）將古氏坩堝或垂融坩堝放回原 400ml燒杯中，加25ml硫酸鐵溶液及25ml水，用玻棒攪拌使氧化亞銅完全溶解， 以 0.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液滴定至微紅色為終點(diǎn)。 同時(shí)吸取 50ml 水，加與測樣 品時(shí)相同量的堿性酒石酸銅甲、乙液，硫酸鐵溶液及水，按同一方法做試劑空白實(shí) 驗(yàn)。6. 計(jì)算 :X仁(V- VO)X NX 71.54

9、式中: X1- 樣品中還原糖質(zhì)量相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量， mg;V- 測定用樣品液消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液的體積， ml;VO- 試劑空白消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液的體積， ml;N-高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 ;71.54-1ml 1mol/L 高錳酸鉀溶液相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量， mg。 根據(jù)(1) 式中 計(jì)算所得氧化亞銅質(zhì)量，查附表 " 氧化亞銅質(zhì)量相當(dāng)于葡萄糖、果糖、乳糖、轉(zhuǎn)化 糖的質(zhì)量表 " ，再計(jì)算樣品中還原糖含量。X2=(m1X V2)?(m2X V1)X (1OO?1OOO) (2)式中: X2- 樣品中還原糖的含量， g/1OOg(g/1OOml);m1 -查表得還原糖質(zhì)量，

10、mg;m2-樣品質(zhì)量(或體積) ， g(ml);V1 -測定用樣品處理液的體積， ml;V2- 樣品處理后的總體積， ml。7. 舉例 :稱取某食物樣品3.00g，經(jīng)過處理后用水定容至250ml。取50ml進(jìn)行測定，消 耗0.1003mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液5.20ml，同時(shí)測試劑空白為0.36ml，貝U樣品中還 原糖質(zhì)量相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量為 :X1(mg) =(5.20- 0.36) X0.1003X71.54 = 34.7 3 查表得還原糖質(zhì)量為相當(dāng)于 葡萄糖 16.22 mg， 樣品中還原糖含量 (以葡萄糖計(jì) )為:X2(g/100g)=(16.22 X 250)?(3.00 X 50

11、) X (100?1000)= 2.70 8.注釋 : 本法用堿性酒石酸銅溶液作為氧化劑。由于硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)可生 成氫氧化銅沉淀，氫氧化銅沉淀可被酒石酸鉀鈉緩慢還原，析出少量氧化亞銅沉 淀，使氧化亞銅計(jì)量發(fā)生誤差，所以甲、乙試劑要分別配制及貯藏，用時(shí)等量混 合。二、直接滴定法1. 原理樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，在加熱條件下，直接滴定已標(biāo)定過的費(fèi)林氏液，費(fèi)林氏 液被還原析出氧化亞銅后，過量的還原糖立即將次甲基藍(lán)還原，使藍(lán)色褪色。根據(jù) 樣品消耗體積，計(jì)算還原糖量。2. 適用范圍GB5009.7-85，本方法適用于所有食品中還原糖的檢測。檢出限0.1mg。3.主要儀器滴定管4. 試劑 除特殊說明外，

12、實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。(1) 費(fèi)林甲液：稱取15 g硫酸銅(CuSO4?5H2Q)及0.05 g次甲基藍(lán)，溶于水 中并稀釋至 1 L 。(2) 費(fèi)林乙液： 稱取 50 g 酒石酸鉀鈉與 75 g 氫氧化鈉，溶于水中，再加入 4 g 亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至 1000ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。(3)乙 酸鋅溶液 ：稱取 21.9 g 乙酸鋅，加 3 ml 冰乙酸，加水溶解并稀釋至 100 ml。(4) 亞鐵氰化鉀溶液。稱取 10.6g 亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至 100ml。 (5) 鹽酸。（6）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 : 精密稱取 1.000 g 經(jīng)過 98100 ? 干燥至恒

13、量的葡萄糖 （純度在 99%以上） ，加水溶解后加入 5ml 鹽酸，并以水稀釋至 1 L 。此溶液相當(dāng)于 1 mg/ml 葡萄糖。 （注: 加鹽酸的目的是防腐，標(biāo)準(zhǔn)溶液也可用飽和苯甲酸溶液配制）（7）果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 : 精密稱取 1.000 g 經(jīng)過 98100 ?干燥至恒量的果糖 （ 純度在 99%以上） ，加水溶解后加入 5ml 鹽酸，并以水稀釋至 1 L 。此溶液相當(dāng)于 1 mg/ml 果糖。（8）乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 :精密稱取 1.000 g 經(jīng)過 96+-2 ? 干燥至恒量的乳糖 （純度在 99%以上） ，加水溶解后加入 5ml 鹽酸，并以水稀釋至 1 L 。此溶液相當(dāng)于 1 mg/ml 乳

14、糖。（9）轉(zhuǎn)化糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1.0526g蔗糖，用100mL水溶解，置具塞三角瓶中，加5mL鹽酸（1+1），在68? 70?水浴中加熱15min,放置至室溫，轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中定量到1000mL此溶液相當(dāng)于1 mg/ml轉(zhuǎn)化糖5.操作方法5.1 樣品處理 ：5.1.1 乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品 ：稱取約 0.5,2 g 固體樣品（吸取 2,10ml 液體樣品 ） ，置于 100 ml 容量瓶中，加 50ml 水，搖勻。邊搖邊慢慢加入 5 ml 乙酸鋅溶液及5 ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。 （注意：乙酸鋅可去除蛋白質(zhì)、

15、鞣質(zhì)、樹脂等，使 它們形成沉淀，經(jīng)過濾除去。如果鈣離子過多時(shí)，易與葡萄糖、果糖生成絡(luò)合物， 使滴定速度緩慢 ;從而結(jié)果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結(jié)合，形成沉淀并 過濾。 ）5.1.2 酒精性飲料：吸取 50 ml 樣品，置于蒸發(fā)皿中，用 1mol/L 氫氧化鈉溶液 中和至中性，在水浴上蒸發(fā)至原體積 1/4后，移入100 ml容量瓶中。加25ml水， 混勻。以下按 4.1.1 自"加5 ml 乙酸鋅溶液"起依法操作。5.1.3 含多量淀粉的食品 : 稱取 2,5 g 樣品，置于 100 ml 容量瓶中，加 50 ml 水，在45?水浴中加熱1h,并時(shí)時(shí)振搖（注意：此步驟

16、是使還原糖溶于水中，切忌溫 度過高，因?yàn)榈矸墼诟邷貤l件下可糊化、水解，影響檢測結(jié)果。） 。冷后加水至刻度，混勻，靜置。吸取 50ml 上清液于另一 100 ml 容量瓶中，以下按 4.1.1 自"5 ml 乙酸鋅溶液 " 起依法操作。5.1.4 汽水等含有二氧化碳的飲料 ： 吸取 50 ml 樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上除 去二氧化碳后，移入 100ml 容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中，再 加水至刻度，混勻后，備用。（ 注意： 樣品中稀釋的還原糖最終濃度應(yīng)接近于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度。 ） 5. 2 標(biāo) 定費(fèi)林氏液溶液 ： 吸取 5.0 ml 費(fèi)林氏甲液及 5.0

17、ml 乙液，置于 150ml 錐形瓶中 （注 意： 甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉淀，應(yīng)將甲液加入乙液，使開始生成的氧化 亞銅沉淀重溶），加水10ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn) 溶液，控制在 2min 內(nèi)加熱至沸，趁沸以每兩秒 1 滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液，直至溶液蘭色剛好褪去并出現(xiàn)淡黃色為終點(diǎn)，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液總體 積，平行操作三份，取其平均值，計(jì)算每 1 0m l （甲、乙液各 5ml） 堿性酒石酸銅溶液 相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量（mg）。（注意:還原的次甲基藍(lán)易被空氣中的氧氧化，恢復(fù)成原 來的藍(lán)色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態(tài)，并且避免滴定時(shí)間過

18、長。 ）5.3 樣品溶液預(yù)測 : 吸取 5.0 ml 費(fèi)林氏甲液及 5.0 ml 乙液，置于 150 ml 錐形 瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢 的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時(shí)，以 每秒 1 滴的速度滴定，直至溶液蘭色褪去，出現(xiàn)亮黃色為終點(diǎn)。如果樣品液顏色較 深，滴定終點(diǎn)則為蘭色褪去出現(xiàn)明亮顏色 （ 如亮紅 ） ，記錄消耗樣液的總體積。 （ 注 意: 如果滴定液的顏色變淺后復(fù)又變深，說明滴定過量，需重新滴定。 ） 5.4 樣品 溶液測定 : 吸取 5.0 ml 堿性酒石酸銅甲液及 5.0 ml 乙液，置于 1

19、50 ml 錐形瓶中， 加水 10 ml ，加入玻璃珠 2 粒，在 2min 內(nèi)加熱至沸，快速從滴定管中滴加比預(yù)測 體積少 1ml 的樣品溶液，然后趁沸繼續(xù)以每兩秒 1 滴的速度滴定直至終點(diǎn)。記錄消 耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。 6. 計(jì)算X3 =(C x v1 x V)?(m x v2 x 1000) x 100式中: X- 樣品中還原糖的含量 (以葡萄糖計(jì) )，%;C- 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， mg/ml;v1- 滴定 10 ml 費(fèi)林氏溶液 (甲、乙液各 5 ml) 消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， ml;v2- 測定時(shí)平均消耗樣品溶液的體積， ml;V- 樣品定容

20、體積， ml;m- 樣品質(zhì)量， g;7. 注意事項(xiàng)(1) 本方法測定的是一類具有還原性質(zhì)的糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽 糖等，只是結(jié)果用葡萄糖或其他轉(zhuǎn)化糖的方式表示，所以不能誤解為還原糖=葡萄糖或其他糖。但如果已知樣品中只含有某一種糖，如乳制品中的乳糖，則可以認(rèn)為 還原糖 =某糖。(2) 分別用葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴定等量已 標(biāo)定的費(fèi)林氏液，所消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積有所不同。證明即便同是還原糖，在物化 性質(zhì)上仍有所差別，所以還原糖的結(jié)果只是反映樣品整體情況，并不完全等于各還 原糖含量之和。如果已知樣品只含有某種還原糖，則應(yīng)以該還原糖做標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果 為該還原糖的含量。如果樣品中還原糖的