國家自然科學基金酸菜版標書范文

1、2015年國家自然科學基金面上項目示例版題目：真核起始因子X-Y軸調控糖基轉移酶對腸癌肝轉移的作用機制摘要：大腸癌術后復發(fā)轉移中，肝、肺轉移是最常見的轉移模式，對其機制一直未能闡明。申請者在前期工作中建立了大腸癌遠處轉移的特征分子譜式，在肝轉移相關分子標志中，發(fā)現(xiàn)真核起始因子Z家族的成員：X和Y具有關鍵調節(jié)作用。X-Y軸能夠介導大腸癌肝轉移的發(fā)生，X可促進細胞獲得運動能力，并且在轉移灶中通過Y的相互作用促進細胞異常增殖。進一步實驗證實，X能調節(jié)下游糖基轉移酶，可能存在激活腸癌細胞膜表面半乳糖殘基，從而通過與肝細胞膜上特異性受體相互作用而使腸癌細胞“定居”于肝臟的機制，可見X-Y調節(jié)軸對于大腸癌

2、肝轉移至關重要。本項目擬在此基礎上，從大樣本回顧性分析中總結X-Y對于結腸癌肝轉移的臨床相關性和預后判斷價值。同時，在細胞和動物模型中進一步深入探討其在結腸癌肝轉移調控中的作用方式和調控分子機制，解析下游效應途徑及靶點。（一）立項依據與研究內容（4000-8000 字）：一、立項依據大腸癌是一種發(fā)生在結腸或者直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病人約八百萬，占所有惡性腫瘤的10%-15%，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第三位1。隨著手術、化療、放療水平的提高，大腸癌患者的生存率有了較大的提高，但遠處轉移是影響其預后的最主要因素。在美國大腸癌中有90%的死亡由腫瘤的遠處轉移所致2。所

3、以，通過對大腸癌轉移機制的研究，正確認識大腸癌術后轉移模式，對于制定合理的術后隨訪方案，采取有針對性的干預措施，提高生存率至關重要。大腸癌最常見的遠處轉移部位是肝臟和肺。對于肝轉移，人們更多的把原因歸結為解剖因素，結腸是通過門靜脈系統(tǒng)回流進入肝臟，所以認為大腸癌的首發(fā)轉移部位往往在肝臟。但是很多臨床研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者術后轉移可以繞開肝臟而首先出現(xiàn)在肺部甚至是甲狀腺轉移3-6，有報道出現(xiàn)首發(fā)肺轉移的大腸癌患者最高可達患者總數(shù)的6%，已經相當可觀7，這就對我們的隨訪策略提出挑戰(zhàn)，對于大腸癌患者即使術后沒有肝轉移，也不能放松對肺部的檢查。而申請者在前期臨床研究中，通過對本院486例行根治手術的大腸癌

4、患者資料研究后發(fā)現(xiàn)：主要通過門靜脈系統(tǒng)回流的高位直腸癌和通過體循環(huán)回流的直腸中、低位直腸癌的術后肺轉移率和肝轉移率都沒有顯著性差異。由此可見，決定大腸癌的術后轉移模式的因素并非僅僅解剖可以闡釋。近年來研究發(fā)現(xiàn)包括原發(fā)腫瘤的分期，術前放化療，轉移靶器官的微環(huán)境等因素都會影響大腸癌的轉移模式8-10，但其確切機制仍然沒有探明。為搜尋大腸癌遠端轉移相關分子靶標并評估其作為預測遠端轉移發(fā)生的潛在分子標志物的可能性，我們前期在臨床上收集了6例珍貴的同時性肝、肺轉移分別切除的患者，將其原發(fā)灶、肝、肺轉移的組織樣本通過高通量的基因芯片技術，從全基因表達譜的角度對這兩種轉移組織的基因表達情況進行了全方位的檢測

5、分析（來源于同一患者的組織樣本可以排除個體遺傳背景的干擾）。我們發(fā)現(xiàn)：有41個基因在兩種大腸癌遠處轉移組織中存在顯著性差異（肝轉移分子群有27個，肺轉移分子群有14個），這些分子可能構成了驅動大腸癌不同轉移模式的分子因素。為進一步確認芯片的結果，我們在47例大腸癌肝轉移和22例肺轉移組織病理樣本中，通過qPCR的方式進行了回顧性驗證，確認了13個在大腸癌肝轉移過程中明顯高表達的基因（5倍以上），區(qū)別于肺轉移，這是一種特異性的表達改變（見前期工作）。這些肝轉移特異的分子標志中，有兩個屬于真核起始因子Z家族的成員：X和Y，引起了我們的研究關注。Z真核起始因子在真核生物翻譯起始過程中起著重要作用，參

6、與了真核生物翻譯起始過程中的多個反應11，但其在腫瘤中的角色功能還尚不十分清楚。我們首先鑒定了Y基因在大腸癌細胞中高表達，并確認Y表達被干擾后，細胞增殖能力被顯著抑制，處于G1期的細胞數(shù)量顯減少，處于S期和G2期的細胞數(shù)量顯著增加，細胞凋亡比例顯著提高，細胞的存活能力顯著下降，克隆形成能力受到顯著抑制。這一結果已發(fā)表于XXX12?？紤]到有報道X與Y之間存在相互結合13-14，我們又進一步觀察了兩者之間的交互作用。有意思的是，X對于Y的促惡性增殖功能是必需的，表現(xiàn)在沉默X表達之后，過表達Y對大腸癌細胞的增殖調控失活。而X本身具有調節(jié)細胞遷移的能力，抑制X可顯著降低細胞運動性（見前期工作）。由此，

7、我們提出科學假設：真核起始因子X-Y軸能夠調控大腸癌肝轉移的發(fā)生，X可介導細胞獲得運動能力，并且在轉移灶中調節(jié)Y發(fā)揮促進腫瘤細胞繼發(fā)性增殖的作用，具體作用機制有待闡明。在哺乳動物中，Z因子的亞基有8種，按分子量從大到小排列而命名15。Z因子參與真核細胞翻譯過程，而調節(jié)蛋白合成在維持細胞生長控制中起重要作用16。據報道，Z因子不僅能通過促進mRNA與40s亞基結合，而且還可以獨自與游離的40s亞基結合，影響40s亞基與60s亞基及其他亞基蛋白的結合或解離等17。Z家族成員一般含有PCI和MPN結構域，這兩類結構域都參與蛋白-蛋白相互作用，部分還具有RNA識別（RNA recognition mo

8、tif，RRM）結構域，可能參與RNA的結合15。除此之外，Z因子還被發(fā)現(xiàn)具有調控細胞周期的作用16,18。通過調節(jié)不同類型的mRNA的翻譯起始，Z因子就可以選擇性地調控蛋白的合成，從而對腫瘤細胞的生長的轉移等生物學行為進行調控16,19。Z家族中部分成員已證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已報道的包括：A、B、C、D等18-22。Y的致癌作用由申請人首先報道，隨后其在膠質瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用也被其他研究者發(fā)現(xiàn) 12,23-25。而關于X與惡性腫瘤的關系目前還未見文獻報道，可見在針對X、Y兩個分子尤其是交互作用方面，申請人尚居于領先的研究地位。更早前，權威雜志J Biol Chem上的

9、報道提示了X在包含Y蛋白的復合物與40S核糖體亞基結合的過程中扮演著關鍵的鏈接作用，缺失X時兩者的結合很不穩(wěn)定，對翻譯起始系統(tǒng)的調節(jié)能力也會降低26。2013年9月，J Biol Chem上又報道了W可與X競爭性結合Y27，從而形成不同的Z復合物。Z復合物負責招募tRNA或mRNA，可調節(jié)下游基因表達，繼而影響腫瘤細胞的生長、遷移等生物學過程。不同的Z因子蛋白結合可能存在不同的翻譯調節(jié)機制從而執(zhí)行不同功能作用。在近期的研究工作中，申請人對X的調控機制進行了進一步深入。敲減X后，基因芯片檢測顯示腸癌細胞中多個關鍵調控節(jié)點發(fā)生了改變。其中，有3個半乳糖基轉移酶（1,3-GalT; 1,4-GalT

10、-1; 1,4-GalT-7）的表達降低了，這引起了我們的興趣。糖基化作為常見的蛋白翻譯后修飾，參與細胞增殖、分化、轉移、侵襲、免疫應答等多種生命活動，糖基化紊亂能夠導致多種腫瘤的發(fā)生與惡性轉化，糖基轉移酶的表達和活性與包括大腸癌在內的多種腫瘤的惡性化程度相關28-29。Tang等發(fā)現(xiàn)1,4-半乳糖基轉移酶1通過調節(jié)EGFR影響肝癌細胞的生長和凋亡30。1,4-半乳糖基轉移酶3通過調節(jié)整聯(lián)蛋白信號通路影響神經細胞瘤的侵襲能力31。此外，半乳糖基轉移酶的激活，可以使細胞膜上蛋白糖基化程度增加32。經過進一步腸癌細胞株的體外實驗驗證，X與半乳糖基轉移酶1,4-GT-1和1,4-GT1-7的表達正相

11、關（見前期工作），我們推測X對半乳糖基轉移酶的調節(jié)作用很可能是它在腸癌中介導腫瘤細胞肝轉移的關鍵。原因在于，肝細胞表面存在一種特異性表達的抗原：去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor, ASGPR），又稱半乳糖受體。ASGPR是一種跨膜蛋白，主要表達于哺乳動物肝竇狀隙的肝實質細胞表面，密度很高，每個細胞表面可多達500,000個受體，其胞外結構域含有糖識別結構域，能識別和結合半乳糖殘基和-乙酰半乳糖胺殘基33。Misawa等34曾經用神經氨酸酶處理骨髓細胞（Bone marrow cell，BMCs），使細胞膜表面的糖蛋白脫去唾液酸而暴露出半乳糖殘基，利用半

12、乳糖殘基與ASGPR的相互作用使BMCs直接聚集到肝臟。我們相信，真核起始因子X在腸癌肝轉移的過程中，可能調節(jié)下游糖基轉移酶，存在一種通過激活腸癌細胞膜表面半乳糖殘基，從而與肝細胞膜上特異性受體ASGPR相互作用而使腸癌細胞“定居”于肝臟的機制，此后，它又可介導Y的促進腫瘤細胞克隆化增殖的能力，最終形成肝組織腫瘤轉移灶。X-Y調節(jié)軸對于大腸癌肝轉移的內在調節(jié)機理是令人期待的。在前期工作基礎上，本項目擬從大樣本回顧性分析中總結X-Y對于結腸癌肝轉移的臨床相關性和預后判斷價值。同時，在細胞和動物模型中進一步深入探討其在結腸癌肝轉移調控中的作用方式和調控分子機制：解析X調節(jié)半乳糖苷轉移酶表達的方式和

13、作用靶點，明確其介導的信號通路，并確認X在Y復合物發(fā)揮功能的效應分子途徑中的作用。以上研究在組織、細胞、動物三個層次展開，并通過分子機制研究進行縱向的突破，以期獲得高水平的研究成果。本項目是對結腸癌肝轉移發(fā)生機制的研究深入，所獲得的研究成果可幫助我們更好判斷腸癌預后，通過肝轉移特征性的分子標志，提示風險，并為相關靶點應用于臨床轉化醫(yī)學奠定理論基礎。主要參考文獻因涉敏感基因信息，略二、項目的研究內容、研究目標，以及擬解決的關鍵科學問題1、研究內容1) 回顧性檢測500例腸癌患者手術標本中X和Y蛋白的表達水平，根據臨床病理數(shù)據和隨訪數(shù)據多因素分析X、Y表達與腸癌肝轉移發(fā)生的相關性，嘗試建立基于X、

14、Y表達的分子預測模型，評價這一預后指標的臨床適用價值。2) 在腸癌細胞株中過表達和沉默X、Y基因，觀察細胞功能變化。在細胞實驗基礎上，應用裸鼠成瘤和肝轉移動物模型進行驗證，觀察X、Y對于腸癌惡性增殖和轉移發(fā)生的影響。結合細胞、動物和組織水平的研究數(shù)據闡明X、Y在腸癌發(fā)生、進展中的功能作用。3) 根據前期工作的下游通路和靶分子分析結果，重點闡明：X與糖基轉移酶之間的調控關系和作用靶點；X與細胞運動性信號通路靶分子的調節(jié)關系；Y復合物調節(jié)的信號通路與效應分子；X與Y相互結合的序列位點和精細調控。2研究目標及考核的技術指標基于Y在腸癌細胞高表達能促進細胞惡性增殖和周期改變，X與Y之間存在相互結合，而

15、X具有調節(jié)細胞遷移的能力，申請者的研究目標在于證實X-Y軸能夠調控大腸癌肝轉移的發(fā)生，X可介導細胞獲得運動能力并在轉移灶中調節(jié)Y發(fā)揮促進腫瘤細胞繼發(fā)性增殖的作用。而在體內、體外明確其促肝轉移功能作用基礎上，X調控結腸癌細胞遷移的分子機制通過以下兩個目標進行深入探討：1) 闡明Y復合物調節(jié)的信號通路與效應分子；2) 確認X與Y相互結合的序列位點和精細調控；3）探討X調節(jié)大腸癌肝轉移模式的具體作用機制。3擬解決的關鍵科學問題及其解決方法本課題所需解決的第一個關鍵科學問題為X和Y在大腸癌肝轉移中的臨床意義，通過大樣本組織中檢測這兩個分子的表達，并利用病理和隨訪數(shù)據進行統(tǒng)計分析，我們可以獲得多因素條件

16、下這兩個靶標的臨床價值。這其中，規(guī)范化的組織樣本庫，隨訪數(shù)據的積累以及統(tǒng)計方法的運用都是重要的影響因素，但申請者所在課題組在這方面從事過多個課題的研究，具有豐富經驗。另一方面，這兩個靶標的檢測有成熟的商業(yè)化抗體，方法學上也不存在困難。本課題第二個關鍵問題也是本課題研究的重點，即X-Y軸在大腸癌肝轉移中的調控分子機制，我們需要闡明Y所介導的遷移功能及糖基轉移酶信號途徑的效應分子和作用方式，并且確認Y與X結合的精細調控及促進腫瘤細胞增殖的分子機制。這方面的工作依賴于扎實的前期工作，首先，我們已經得到Y和X沉默后功能表型的結果，即Y可調控細胞增殖，而X能夠調節(jié)細胞遷移，并影響Y對腫瘤的促增殖作用，在

17、此基礎上做機制研究有的放矢。其次，我們已篩查和驗證到X可通過調節(jié)兩個糖基轉移酶對腸癌細胞肝臟種植起到調節(jié)作用，在本課題中，我們需要深入做的工作是揭示X如何調節(jié)細胞遷移功能，其下游調節(jié)糖基轉移酶是否與肝臟特異性的轉移相關，以及它們具體的作用機制是怎樣的。在邏輯清晰的機制通路假設中，我們只需逐條驗證，即可真正揭開X作用通路的神秘面紗。最后，Y和X之間的cross-talk有創(chuàng)新性且立足于前期研究的數(shù)據支持，只需將X-Y復合物調節(jié)的位點和下游與細胞增殖功能相關的機制闡釋清楚，即可形成完成的研究故事?？紤]到腫瘤細胞增殖機制方面報道眾多，可參考模式豐富，這方面的研究也不會有太大的科學風險。三、擬采取的研

18、究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析1. 技術路線備注：藍色背景填充部分為前期已完成工作。2. 研究方法2.1 X、Y在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和預后相關性1) 回顧性收集腸癌臨床標本500例，取手術切除的腸癌組織、匹配的肝臟轉移灶手術和穿刺標本，新鮮組織液氮保存標本200例，石蠟塊300例，全部病例均通過臨床、影像學、病理診斷，術前未進行輔助治療，來自某某醫(yī)院2008-2013年臨床收治病例，隨訪資料齊全。 2) 免疫組化檢測組織切片中X、Y蛋白的表達及定位，分別設立陰性對照、腫瘤對照、肝轉移對照。3) SPSS16.0統(tǒng)計軟件對X、Y表達及定位與臨床標本進行病理關聯(lián)性分析和預后統(tǒng)計分析，

19、了解X、Y表達情況與相關臨床資料之間的關系，單因素生存分析對臨床各項指標與結腸癌生存期進行相關性分析，建立Cox比例風險回歸模型，綜合探討臨床各因素和X、Y表達與結腸癌肝轉移、轉移灶形成及預后的相關性。2.2 體外、體內水平研究X、Y基因在腸癌肝轉移中的調節(jié)功能1) 制備X-shRNA慢病毒，建立X穩(wěn)定沉默的細胞株，以無義序列作為陰性對照，利用MTT實驗觀察X沉默后細胞的生長曲線；克隆形成實驗檢測X沉默后細胞的克隆形成能力；流式細胞術結合PI單染、Annexin-V雙染檢測細胞周期和凋亡情況；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。與此同時，制備過表達X的慢病毒載體。2)

20、在穩(wěn)定沉默X的結腸癌細胞中，導入過表達Y的慢病毒載體，利用細胞生長曲線觀察X沉默且Y過表達后細胞的增殖能力變化；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。同樣地，在穩(wěn)定沉默Y的結腸癌細胞中，導入過表達X的慢病毒載體，利用細胞生長曲線觀察Y沉默&X過表達后細胞的增殖能力變化；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。3) 制備結腸裸鼠皮下移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，建立生長曲線，統(tǒng)計分析Y和X對結腸癌細胞體內成瘤能力的影響，明確Y和X在結腸癌惡性增殖的作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達組、Y沉默組+X過表達組。4) 建立

21、結腸癌肝轉移動物模型，觀察肝臟中的轉移灶，統(tǒng)計分析Y和X對結腸癌肝轉移能力的影響，明確Y和X在結腸癌肝轉移過程中的作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達組、Y沉默組+X過表達組。5) 處死裸鼠取得的腫瘤組織，利用qRT-PCR和免疫組化方法檢測Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表達；部分腫瘤組織制備成冰凍切片，利用FITC和TRITC雙標記免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察X與Y的共定位情況。2.3. X-Y軸調節(jié)結腸癌肝轉移的分子機制研究1) 通過基因芯片Microarray分析X過表達/沉默后基因表達譜變化情況，對原始數(shù)據進行歸一化、標準化，差異表達分

22、析，明確X消減后表達發(fā)生改變的下游調控分子，芯片結果中有顯著差異的潛在作用分子，設計引物，通過qRT-PCR進行二次表達驗證。2) X基因過表達/沉默后發(fā)生顯著表達差異的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis軟件進行signaling network 重建。解析X調控結腸癌細胞運動能力的信號通路網絡，構建X為核心的信號分子網絡。3) 根據X基因沉默后影響的信號通路結果（半乳糖基轉移酶及其上游調節(jié)信號通路），利用信號通路抑制劑處理X穩(wěn)定過表達/沉默后結腸癌細胞和對照細胞，檢測不同分子信號對X表達及功能的作用，驗證阻斷這些信號通路后對X在

23、結腸癌中的功能表型的影響。4) 采用信號通路高通量檢測蛋白芯片，根據以上實驗分析的通路情況，訂購相應通路的Pathway Array試劑盒，按試劑盒操作，依據封閉、加入細胞裂解液、洗脫、加入抗體混合液、再次洗脫，加入辣根過氧化物酶HRP并洗脫、信號檢測的步驟，檢測X基因表達變化后的特定通路關鍵蛋白的變化。5) 分別構建X、Y的真核表達載體，共轉293T，通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證XY的相互結合作用。6) 應用生物信息學技術模擬X與Y的結合位點。在結合位點制備不同氨基酸的突變體。采用RNAi方法敲減互作蛋白表達，接著轉入互作蛋白的突變體，檢測細胞功能表型變化。通過免疫共沉淀（Co-IP）驗

24、證X與Y之間的結合位點特異性。7) EMSA實驗驗證X與Y之間的相互作用關系，參考蛋白相互作用實驗，設計突變載體，再驗證其結合特異性，由此揭示X作為Y調節(jié)蛋白其對下游RNA進行調控的精細機制。3. 可行性分析1) 研究目標切實可行：我們前期的工作已明確證實：Y可以調節(jié)結腸癌的惡性增殖，并且進行了大量的預實驗，可支持本課題主要科學假設。本項目是對前期研究工作的進一步補充和完善，具有較好的可行性。2) 技術平臺與硬件設施完善：課題組成員長期從事結直腸癌的診治和發(fā)生發(fā)展機制研究，在免疫組化、免疫印跡、實時熒光定量PCR、RNA 干擾、慢病毒包裝、表達譜芯片研究等各個方面積累了大量的經驗，本項目中所用到的實驗技術以前均有所涉及，為本項目的實施提供了技術保障。本項目所需的主要儀器設備目前均已經具備。3) 研究基礎扎實：本課題組成員長期從事結直腸癌的基礎和臨床研究，具有良好的科研素質。在國內外雜志上發(fā)表了多篇結直腸癌基礎研究和臨床研究相關的論文。4) 臨床標本充足：仁濟醫(yī)院普外科長期從事結直腸