BrdU染色原理和步驟

1、BrdU染色原理和步驟染色原理和步驟YTH-xianyuanruxiaEdU染色方法簡介染色方法簡介BrdU染色原理染色原理oBrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復(fù)制細(xì)胞中新合成的DNA中（細(xì)胞周期S期）。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞中。 BrdU 特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。 BrdU 特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。 o活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖

2、細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣 o摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu，以氫鏈與腺嘌呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu抗體反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體孵育、呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。 改進(jìn)和發(fā)展o由于鹽酸和蛋白酶處理等可引起抗原或組織形態(tài)發(fā)生變化。為此，Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體（Bu1），其培養(yǎng)液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應(yīng)，因?yàn)榕囵B(yǎng)液上清中含有D

3、NA酶，可分解雙鏈DNA，顯露Brdu，達(dá)到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶鹽酸處理，亦得到了良好的染色結(jié)果。用雙重或多重染色、觀察何種細(xì)胞分裂增殖時(shí)，首先應(yīng)染色其它抗原物質(zhì)，最后顯示Brdu。o通常在第一種抗體呈色后，再經(jīng)1%戊二醛固定510min，重復(fù)染色程序，均可獲得較滿意的染色結(jié)果，分裂細(xì)胞核呈棕褐色；顯示其它抗原用ALP標(biāo)記抗體，則細(xì)胞漿為紅色（FR）或藍(lán)色（FB） 操作步驟操作步驟 （1）o（1）細(xì)胞以1.5105 /ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中（內(nèi)放置一蓋玻片），培養(yǎng)1 d，用含0.4FBS培養(yǎng)液同步化3 d，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。o（2）加入BrdU（儲(chǔ)液：1

4、.0 mg/ml,終濃度為0.03 g/ml），37，孵育40min。o（3）棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。o（4）甲醇/醋酸固定10 min。o（5）經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3H2O2 -甲醇 30 min滅活內(nèi)源性氧化酶。o（6）5正常兔血清封閉。o（7）甲酰胺100，5 min變性核酸。o（8）冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50），陰性對(duì)照加PBS或血清。o（9）按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算標(biāo)記指數(shù)（LI）。BrdU staining protocoloMaterials a

5、nd reagentsnHydrogen chloride (HCl), 1 M and 2 MnBorate buffer 0.1 MnBorax (sodium tetraborate) 38.1 g/liter, pH to 9.0nPhosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, with 0.1% Triton X-100Methodo1. Sections of paraffin-embedded tissues should be de-waxed before proceeding.o2. Incubate in HCl (1 M) for 10

6、 min on ice to break open the DNA structure of the labeled cells.o3. This is followed by HCl (2 M) for 10 min at room temperature, then 20 min at 37C.o4. Immediately after the acid incubations, neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature.o5. Wash in P

7、BS (pH 7.4), 0.1% Triton X-100 3 times, 5 min per wash.o6. Continue with standard staining procedure as described in the immunohistochemistry and cytochemistry protocols.注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)o1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml雙蒸水，4下避光保存o2.BrdU會(huì)肌體造成不可逆損傷，使用時(shí)注意安全，避免吸入BrdU粉塵。BrdU染色的進(jìn)化染色的進(jìn)化-EdUoEdU（5-Ethynyl-2-deoxyuridine）是一種是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見，能夠在合物中很少見，能夠在DNA復(fù)制時(shí)期代替胸腺嘧復(fù)制時(shí)期代替胸腺嘧啶啶(T)滲入正在合成的滲入正在合成的DNA分子中，基于分子中，基于Apollo熒光染料與熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接的特異性反應(yīng)即可直接并準(zhǔn)確地檢測出并準(zhǔn)確地檢測出DNA復(fù)制活性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞復(fù)制活性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長與發(fā)育、