質(zhì)粒提取和電泳PPT課件

1、重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒的鑒定平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑赜匈|(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的細(xì)胞組質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定第1頁(yè)/共26頁(yè)如何鑒定平板上的菌落為含有重組質(zhì)粒的菌落？如何鑒定平板上的菌落為含有重組質(zhì)粒的菌落？平板篩選：平板篩選： 大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蚝匈|(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含

2、有空質(zhì)粒或重組質(zhì)粒的細(xì)胞重組質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定第2頁(yè)/共26頁(yè)第3頁(yè)/共26頁(yè)質(zhì)粒質(zhì)粒載體是存在于細(xì)菌染色體外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立自主復(fù)制并賦予宿主細(xì)胞一定的遺傳性狀篩選標(biāo)記MCS（多克隆位點(diǎn)）復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒第4頁(yè)/共26頁(yè)1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；2)收集裂解細(xì)菌；收集裂解細(xì)菌；3)分離純化質(zhì)粒分離純化質(zhì)粒DNA。 質(zhì)粒提取原理：質(zhì)粒提取有多種方法，但都包含有3個(gè)基本步驟：去除蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)去除基因組去除基因組DNA去除去除RNA*酚酚-氯仿抽提法

3、氯仿抽提法*RNase消化消化？第5頁(yè)/共26頁(yè)大腸桿菌遺傳物質(zhì)大腸桿菌遺傳物質(zhì)1、部位不同：2、大小不同： 質(zhì)粒分子量較小，大小只有普通細(xì)菌染色體DNA的百分之一。 基因組DNA分子量較大，細(xì)菌基因組約含3000個(gè)基因，5106 bp?；蚪MDNA容易斷裂線性化第6頁(yè)/共26頁(yè)提取的質(zhì)粒的方法：提取的質(zhì)粒的方法：特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡(jiǎn)便、快捷特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡(jiǎn)便、快捷應(yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克隆（粗提）應(yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克隆（粗提） 測(cè)序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）測(cè)序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）1. 1. 小量堿裂解法小量堿裂解法2. 2. 質(zhì)粒提取試劑盒質(zhì)粒提取試劑盒純化原理：離子交換柱層析等純化原理：離子交

4、換柱層析等小量制備質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒kit大量制備質(zhì)粒大量制備質(zhì)粒kit去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒kit質(zhì)粒提取試劑盒可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒提取試劑盒可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)，本次試驗(yàn)不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，只講解結(jié)果分本次試驗(yàn)不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，只講解結(jié)果分析。析。第7頁(yè)/共26頁(yè)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理堿裂解法提取質(zhì)粒的原理原理：1、強(qiáng)堿和SDS裂解細(xì)菌，細(xì)菌中的質(zhì)粒或基因組DNA在堿性條件下發(fā)生變性。2、怎樣去除基因組DNA？ 當(dāng)加入酸性物質(zhì)進(jìn)行中和時(shí)，質(zhì)粒DNA很快復(fù)性， 染色體DNA則和變性蛋白質(zhì)等纏繞在一起難以復(fù)性而形成沉淀，經(jīng)離心隨細(xì)胞碎片一起去除；3、怎樣去除蛋白質(zhì)？ （已經(jīng)學(xué)過(guò)）

5、留有質(zhì)粒DNA的上清，經(jīng)酚和氯仿去除蛋白質(zhì)后, 用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，即得到質(zhì)粒DNA.第8頁(yè)/共26頁(yè)1) 細(xì)胞懸浮液（溶液細(xì)胞懸浮液（溶液I）-懸浮菌體懸浮菌體50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.010 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.02) 細(xì)菌裂解液（溶液細(xì)菌裂解液（溶液II） -裂解菌體裂解菌體0.2mol/L NaOH1% SDS堿裂解法提取質(zhì)粒試劑：第9頁(yè)/共26頁(yè)3）中和液（溶液III） -中和NaOH60 ml 5mol/L 醋酸鉀11.5ml 冰醋酸28.5ml 水4）20mg/ml RNase-降解細(xì)菌RNA工作濃度3

6、050 g/ml其他試劑作用和成分同實(shí)驗(yàn)一。質(zhì)粒DNA的制備第10頁(yè)/共26頁(yè)（1）（細(xì)菌的收獲：）細(xì)菌的收獲：） 取取1.5 ml 工程菌液工程菌液6,000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心2min， 棄上清。棄上清。（2）（細(xì)菌的裂解：）細(xì)菌的裂解：） 加入加入200 l預(yù)冷的細(xì)胞懸浮液（溶液預(yù)冷的細(xì)胞懸浮液（溶液I）懸浮懸浮細(xì)細(xì)菌菌 加入加入200 l細(xì)菌裂解液（溶液細(xì)菌裂解液（溶液II），）， 顛倒混合離心管內(nèi)容物，待溶液變粘稠為止。顛倒混合離心管內(nèi)容物，待溶液變粘稠為止。 注：注： 粘稠粘稠 ：開蓋后出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，證明：開蓋后出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，證明DNA已經(jīng)游出。已經(jīng)游出。（3）（中和：）（中和：

7、）加入加入150 l中和液，上下顛倒混合后置中和液，上下顛倒混合后置 冰上冰上 5min， 12,000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，分， 4離心離心 5min。 第11頁(yè)/共26頁(yè)（去除蛋白質(zhì)） （4） 將上清移至另一離心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等體積的TE飽和的酚/氯仿/異戊醇(25：24:1)混和液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心 5min。（5）將上層水相移至另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，振蕩混勻1min， 12,000轉(zhuǎn)/分 離心 5min 。（沉淀DNA）（6）將上層水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇， 置-20沉淀1015 min。上午實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)束上午實(shí)驗(yàn)結(jié)束第12頁(yè)/共26頁(yè)（7 7） 12,000 轉(zhuǎn)/分離心5min。 棄上清，室溫干燥質(zhì)粒DNA 5-10minDNA 5-10min。（去除RNA）（8 8）用20 l含RNase的水溶解質(zhì)粒DNA， 輕輕吹打混合。 37 保溫10min20 l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液取出取出10 l放于另一個(gè)離心管中備用放于另一個(gè)離心管中備用剩余剩余10 l用于下一步酶切用于下一步酶切第13頁(yè)/共26頁(yè)重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒的鑒定平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑亟M

9、質(zhì)粒的細(xì)胞有空質(zhì)粒或重組質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定第14頁(yè)/共26頁(yè)質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒DNA的3種形式泳動(dòng)速度:超螺旋線性開環(huán) 質(zhì)粒DNA的存在形式有3種:1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在 2、開環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子 3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.開環(huán)開環(huán)超螺旋超螺旋線性線性第15頁(yè)/共26頁(yè)在一微量離心管中加入： 1. 重組質(zhì)粒DNA 10 ul 2. 10 X Buffer M 2

10、 ul 3. EcoRI 0.5 ul 4. Hind 0.5 ul 5. 去離子水 6 ul 總體積 20 ul 置37 ， 45 min。第16頁(yè)/共26頁(yè) 取取10 ul 酶切后的質(zhì)粒酶切后的質(zhì)粒 加加2 3 ul電泳上樣液，混勻。電泳上樣液，混勻。 加入點(diǎn)樣孔加入點(diǎn)樣孔 電泳：電泳： 100伏，伏，40分鐘。分鐘。注：可將注：可將 5ul 未切的質(zhì)粒作為對(duì)照。未切的質(zhì)粒作為對(duì)照。第17頁(yè)/共26頁(yè)質(zhì)粒電泳質(zhì)粒電泳空質(zhì)粒空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒分子量變大而在重組質(zhì)粒分子量變大而在電泳中滯后電泳中滯后質(zhì)粒酶切電泳質(zhì)粒酶切電泳a:酶切前酶切前b:酶切后酶切后插入片段插入片段注： 觀察質(zhì)

11、粒的電泳帶型 分析質(zhì)粒切不開的原因。第18頁(yè)/共26頁(yè)4.4.CR產(chǎn)物與產(chǎn)物與T載體連接載體連接3. RT-PCR5.5. 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化2.提取提取RNA、 電泳電泳實(shí)驗(yàn)課總結(jié) -基因克隆總結(jié)1.1. 基因組基因組DNA提取、酶切、電泳提取、酶切、電泳第19頁(yè)/共26頁(yè)（1）基因組DNA提取、酶切、電泳1)建立基因組文庫(kù)的第一步建立基因組文庫(kù)的第一步2)人類基因組測(cè)序的第一步人類基因組測(cè)序的第一步3)Southern blot的第一步的第一步Smear1 2 3第20頁(yè)/共26頁(yè) （2）RNA的提取、電泳的提取、電泳1)RT-PCR的第一步，也是目的的第一步，也是目的基因獲得的第一步；基因獲得的第

12、一步；2)Northern blot的第一步；的第一步；注意：注意：RNA提取過(guò)程中提取過(guò)程中主要避免主要避免RNA酶的污染。酶的污染。第21頁(yè)/共26頁(yè)（3） PCR及電泳分析及電泳分析1)獲得目的基因的最常用方法；獲得目的基因的最常用方法；2)可以進(jìn)行探針標(biāo)記；可以進(jìn)行探針標(biāo)記；3)可以進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變可以進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變4)PCR酶切片段長(zhǎng)度分析（酶切片段長(zhǎng)度分析（PCR-RFLP）；）；5)可以定量分析基因含量（可以定量分析基因含量（real time PCR）.注意：引物設(shè)計(jì)是非常重要的。注意：引物設(shè)計(jì)是非常重要的。第22頁(yè)/共26頁(yè)（4）T-A連接、轉(zhuǎn)化連接、轉(zhuǎn)化1）PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的T/A克隆克隆2）感受態(tài)細(xì)胞的制備；）感