實(shí)驗(yàn)1-大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

1、第一章第一章 微生物的利用微生物的利用實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離大腸桿菌的培養(yǎng)和分離什么是微生物？什么是微生物？乳酸桿菌乳酸桿菌黑曲霉黑曲霉微生物：微生物：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物低等生物。什么是培養(yǎng)基？什么是培養(yǎng)基？三角瓶三角瓶培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿試管試管液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：擴(kuò)大培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)擴(kuò)大培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)。固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：分離純化，鑒定菌種，計(jì)數(shù)，保藏。分離純化，鑒定菌種，計(jì)數(shù)，保藏。凝固劑：瓊脂凝固劑：瓊脂培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)成分功能和來源功能和來源碳源碳源氮源氮源生長(zhǎng)因子生

2、長(zhǎng)因子水水無機(jī)鹽無機(jī)鹽提供提供碳元素碳元素：主要是糖類：主要是糖類提供提供氮元素氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素：蛋白胨、牛肉膏、尿素維生素、氨基酸和含氮堿基維生素、氨基酸和含氮堿基H2O，良好的溶劑良好的溶劑NaCl：維持一定的滲透壓：維持一定的滲透壓LB 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制LB固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：蛋白胨蛋白胨 0.5g，酵母提取物酵母提取物 0.25g，氯化，氯化鈉鈉 0.5g，加水，加水50 mL，瓊脂瓊脂 1g。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH 至至7.6。封口膜封口膜菌落：?jiǎn)渭?xì)菌的克隆菌落：?jiǎn)渭?xì)菌的克隆菌落：菌落：在在固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基上，由上，由單個(gè)細(xì)菌單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的一個(gè)繁殖而來的一個(gè)肉眼

3、可見的具有特定形狀的肉眼可見的具有特定形狀的子細(xì)胞群體子細(xì)胞群體。霉菌霉菌大腸桿菌大腸桿菌菌落的作用：菌落的作用：鑒定菌種的重要依據(jù)鑒定菌種的重要依據(jù)菌落特征：菌落特征：菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌：大腸桿菌：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。怎樣無菌操作？怎樣無菌操作？高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿、試管、試管、三角瓶三角瓶、槍頭、槍頭、玻璃三玻璃三角刮刀角刮刀、接種環(huán)接種環(huán)、鑷子。、鑷子。在在121下滅菌下滅菌15 min。高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿三角瓶三角瓶玻璃三角

4、刮刀玻璃三角刮刀接種環(huán)接種環(huán)微量移液器微量移液器槍頭槍頭棉花塞、封口膜、牛皮紙或舊報(bào)紙、橡皮筋棉花塞、封口膜、牛皮紙或舊報(bào)紙、橡皮筋不能用脫脂棉：易吸水，容易引起污染。不能用脫脂棉：易吸水，容易引起污染。酒精燈和酒精棉球酒精燈和酒精棉球滅菌：滅菌：殺死所有微生物。殺死所有微生物。消毒：消毒：殺死部分微生物殺死部分微生物（不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子）。）。超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)打開紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌打開紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30 min。點(diǎn)燃酒精燈點(diǎn)燃酒精燈酒精棉擦拭桌面酒精棉擦拭桌面酒精棉球擦手。酒精棉球擦手。酒精燈火焰附近旁進(jìn)行酒精燈火焰附近旁進(jìn)行灼燒滅菌灼燒滅菌防止雜菌污染防止雜菌污染

5、用細(xì)菌過濾器除菌：用細(xì)菌過濾器除菌：尿素加熱會(huì)分解，用尿素加熱會(huì)分解，用G6玻璃砂玻璃砂漏斗漏斗過濾。過濾。什么是倒平板？什么是倒平板？將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后制成的培養(yǎng)基。制成的培養(yǎng)基。Step1：培養(yǎng)基的配制和滅菌：培養(yǎng)基的配制和滅菌將將50 mL LB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基、50 mL LB固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)和培養(yǎng)皿進(jìn)行皿進(jìn)行高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌。無菌水無菌水培養(yǎng)皿用牛皮紙包扎培養(yǎng)皿用牛皮紙包扎Step2：倒平板：倒平板在酒精燈火焰旁在酒精燈火焰旁將三角瓶中的將三角瓶中的固體培養(yǎng)基（冷卻到固體培養(yǎng)基

6、（冷卻到60）倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，置于水平放置上，并倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，置于水平放置上，并輕輕晃動(dòng)輕輕晃動(dòng)，待，待凝固凝固后形成平面。后形成平面。超凈臺(tái)超凈臺(tái)Step3：接種后擴(kuò)大培養(yǎng)：接種后擴(kuò)大培養(yǎng)將將斜面斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種接種到到滅菌后的液滅菌后的液體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基中，使其在中，使其在37搖床培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12 h 。恒溫?fù)u床恒溫?fù)u床Step4：平板劃線分離：平板劃線分離用用接種環(huán)接種環(huán)在培養(yǎng)大腸桿菌的三角瓶中在培養(yǎng)大腸桿菌的三角瓶中蘸取菌液一次蘸取菌液一次，在，在固體培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線平板上連續(xù)劃線。將。將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)皿倒置，放在，放在37

7、恒溫箱中恒溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)1224 h。怎樣在平板上劃線？怎樣在平板上劃線？1次次2次次3次次4次次連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法原因：原因：隨著隨著劃線次數(shù)的增加劃線次數(shù)的增加，菌數(shù)越來越少菌數(shù)越來越少，最終在劃，最終在劃線的末端出現(xiàn)由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來的線的末端出現(xiàn)由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來的單個(gè)菌落單個(gè)菌落。為什么通過劃線分離可得到單菌落？為什么通過劃線分離可得到單菌落？原因：原因：既可以使培養(yǎng)基表面的既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防，又可以防止止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基中造成污染。中造成污染。恒溫培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)皿倒置恒溫培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)皿倒置

8、培養(yǎng)皿倒置皿蓋皿蓋皿底皿底恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱Step5：菌種的斜面保存：菌種的斜面保存將接種環(huán)將將接種環(huán)將單菌落單菌落取出，用劃線法接種在取出，用劃線法接種在斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基基上，上，37培養(yǎng)培養(yǎng)24 h后，置于后，置于4冰箱冰箱中保存。中保存。斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基試管斜面培養(yǎng)基的制作試管斜面培養(yǎng)基的制作方法：方法：將未凝固的含有瓊脂的培養(yǎng)基加入試管中，滅菌將未凝固的含有瓊脂的培養(yǎng)基加入試管中，滅菌后將后將試管斜放，令其冷卻試管斜放，令其冷卻，固體培養(yǎng)基即成為，固體培養(yǎng)基即成為斜面斜面。平板劃線分離法平板劃線分離法灼燒接種環(huán)灼燒接種環(huán)外焰外焰先灼燒后冷卻：先灼燒后冷卻：以免接種環(huán)溫度太高，

9、殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng)在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng) 基上劃線基上劃線恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)。每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)。總是從上一次劃線的末端開始劃線。總是從上一次劃線的末端開始劃線。稀釋涂布分離法稀釋涂布分離法用用無菌吸管無菌吸管吸取吸取1mL細(xì)菌培養(yǎng)液細(xì)菌培養(yǎng)液加入另一個(gè)盛有加入另一個(gè)盛有9mL無菌水無菌水的試管中，混合均勻，以此制成的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍倍的稀釋液。的稀釋液。梯度稀釋菌液：梯度稀釋

10、菌液：10-510-7倍倍滴加菌液滴加菌液用用無菌吸管無菌吸管取取0.1mL稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。的固體培養(yǎng)基上。用玻璃刮刀涂布用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒玻璃涂棒將將玻璃刮刀玻璃刮刀放在酒精燈火焰上灼燒，待玻璃刮刀冷卻后，在酒放在酒精燈火焰上灼燒，待玻璃刮刀冷卻后，在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿，將精燈旁打開培養(yǎng)皿，將菌液涂布菌液涂布到整個(gè)培養(yǎng)基表面。到整個(gè)培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿倒置，在將培養(yǎng)皿倒置，在37恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)2448 h。 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱結(jié)果：結(jié)果：以每個(gè)培養(yǎng)皿中有以每個(gè)培養(yǎng)皿中有20個(gè)以內(nèi)的個(gè)以內(nèi)的

11、單菌落單菌落最為合適。最為合適。10-110-210-310-410-5倒平板倒平板平板劃線分離平板劃線分離練一練，識(shí)一識(shí)練一練，識(shí)一識(shí)稀釋涂布分離稀釋涂布分離接種環(huán)接種環(huán)玻璃刮刀玻璃刮刀例題：例題：要獲得遺傳特性單一的要獲得遺傳特性單一的大腸桿菌菌種大腸桿菌菌種，一般必須對(duì)，一般必須對(duì)原有的大腸桿菌菌種進(jìn)行原有的大腸桿菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，并利用，并利用純化技術(shù)純化技術(shù)得到得到單菌落的菌種單菌落的菌種。請(qǐng)回答下列有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)。請(qǐng)回答下列有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)的相關(guān)問題：驗(yàn)的相關(guān)問題：（1）對(duì)買回來的大腸桿菌菌種進(jìn)行）對(duì)買回來的大腸桿菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，一般用

12、，一般用LB培培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中為微生物提供養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中為微生物提供碳源、氮源和能源碳源、氮源和能源的物質(zhì)的物質(zhì)主要是主要是，為，為調(diào)節(jié)滲透壓調(diào)節(jié)滲透壓，要加入一，要加入一定量的定量的。為進(jìn)行大腸桿菌的。為進(jìn)行大腸桿菌的分離分離，還要加入，還要加入 配配制成固體培養(yǎng)基，并進(jìn)行制成固體培養(yǎng)基，并進(jìn)行倒平板倒平板的操作。的操作。蛋白胨和酵母提取物蛋白胨和酵母提取物氯化鈉氯化鈉瓊脂瓊脂（2）獲得）獲得純凈微生物培養(yǎng)物純凈微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是的關(guān)鍵是，為，為此，必須對(duì)培養(yǎng)此，必須對(duì)培養(yǎng)器皿、接種用具器皿、接種用具和培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格滅菌。培和培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格滅菌。培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基一般采用養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基一般采用 法滅菌，接種環(huán)采用法滅菌，接種環(huán)采用灼燒法滅菌灼燒法滅菌。同時(shí)在。同時(shí)在接種或倒平板接種或倒平板操作時(shí)，除了在超凈臺(tái)上操作時(shí)，除了在超凈臺(tái)上進(jìn)行操作并對(duì)實(shí)驗(yàn)者的衣著、手和實(shí)驗(yàn)空間進(jìn)行嚴(yán)格清潔和進(jìn)行操作并對(duì)實(shí)驗(yàn)者的衣著、手和實(shí)驗(yàn)空間進(jìn)行嚴(yán)格清潔和消毒外，還必須消毒外，還必須 以防止空氣中的雜以防止空氣中的雜菌污染。菌污染。（3）大腸桿菌菌種的）大腸桿菌菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)基，接種一般采用液體培養(yǎng)基，接種后將培養(yǎng)基置于后將培養(yǎng)基置于37搖床振蕩搖床振蕩條件下培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h。菌種的。菌種的分離分離一般在固體培養(yǎng)基上采用一般在固體培養(yǎng)基上采用法，并將培養(yǎng)皿以法，