微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件NY T 1114

1、；微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件（NY/T 1114-2006）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物肥料實驗室使用的培養(yǎng)基技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗、菌種培養(yǎng)與保藏用培養(yǎng)基的制備。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 19524.1-2004   肥料中糞大腸菌群的測定NY 527-2002    &

2、#160;    光合細(xì)菌菌劑3術(shù)語和定義培養(yǎng)基 medium由人工配制的適合微生物生長、代謝、繁殖和保存的營養(yǎng)基質(zhì)。4培養(yǎng)基制備流程圖（略）5培養(yǎng)基選用原則5.1含有滿足所培養(yǎng)的微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)。5.2各種營養(yǎng)物質(zhì)要有合適的比例和濃度。5.3有合適的pH范圍和一定的緩沖pH能力。5.4有一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。5.5對于特殊用途的培養(yǎng)基，除遵循以上原則外，還應(yīng)滿足以下要求：5.5.1在選擇培養(yǎng)基中，應(yīng)加入利于目的微生物生長而抑制其它微生物生長的化學(xué)物質(zhì)。5.5.2菌種保藏培養(yǎng)基選用原則5.5.2.1對于產(chǎn)芽孢或孢子的菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)以易產(chǎn)生芽孢

3、或孢子為原則。5.5.2.2對于自養(yǎng)微生物的菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)只使用無機鹽類，不使用有機物。5.5.2.3對能利用無機氮源的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中不宜使用有機氮源。5.5.2.4對營養(yǎng)缺陷型微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中必須含有該缺陷所需的物質(zhì)。5.5.2.5對耐某種藥物的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中應(yīng)含有一定濃度的該種藥物。6要求6.1材料6.1.1用于配制培養(yǎng)基的化學(xué)試劑純度至少為化學(xué)純。6.1.2試劑出現(xiàn)顏色改變、沉淀、混濁、吸潮結(jié)塊的現(xiàn)象時，不宜使用。6.1.3天然原材料應(yīng)質(zhì)量穩(wěn)定，未發(fā)生霉變、生蟲和變質(zhì)。6.1.4瓊脂凝固后應(yīng)具有良好的透明度。6.2器皿6.2.1配制試劑所用的器皿應(yīng)潔凈

4、。6.2.2盛裝培養(yǎng)基的器皿應(yīng)由對微生物無毒害并耐高溫的材料制成。6.2.3材料需加熱溶解時，可選用玻璃容器、搪瓷缸和不銹鋼容器等，禁用銅制、鋁制和鐵制容器。6.3棉塞或硅膠塞6.3.1不應(yīng)使用脫脂棉制作棉塞。6.3.2使用棉塞或硅膠塞時，將其長度的2/3塞入容器內(nèi)。要求松緊適當(dāng)，緊貼管壁。6.3.3滅菌時，棉塞外要加包牛皮紙或耐高溫透氣塑料薄膜，以防止滅菌時棉塞受潮或進(jìn)水。6.4培養(yǎng)基配制6.4.1材料稱量6.4.1.1根據(jù)培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取相應(yīng)材料的量。6.4.1.2當(dāng)配方中某種成分微量時，可預(yù)先將該成分配制成一定濃度的母液，然后按量加入。母液須低溫保存。6.4.2材料溶解6.4.2.1

5、不溶于水的組分應(yīng)在所需的溶劑中溶解后，再加入到培養(yǎng)基中。6.4.2.2非溶性組分，如CaCO3,應(yīng)最后加入。6.4.2.3易形成沉淀的組分應(yīng)分別溶解。6.4.2.4不易溶解的組分應(yīng)做預(yù)處理。加熱溶解過程中一旦出現(xiàn)焦化現(xiàn)象時應(yīng)棄用。6.4.2.5培養(yǎng)基中含有指示劑或有顏色的試劑時，應(yīng)在培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)好之后再加入。6.4.3pH測定與調(diào)節(jié)6.4.3.1用精密pH試紙或酸度計測定培養(yǎng)基的pH。6.4.3.2培養(yǎng)基的pH用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)過程中不可用酸堿溶液反復(fù)調(diào)節(jié)。6.4.4分裝裝入三角瓶的培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過其容量的1/2，裝入試管的培養(yǎng)基體積為其容量的1/41/5。分裝過程中防止培養(yǎng)基粘附

6、在瓶口或管口。6.4.5滅菌6.4.5.1高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌控制的條件為121、維持30min。當(dāng)培養(yǎng)基中含有不耐高溫的組分時，可采用115、維持15min30min。6.4.5.2過濾除菌在無菌條件下，將待除菌溶液經(jīng)濾膜為0.2m的細(xì)菌過濾器，達(dá)到除菌的目的。適用于易受高溫破壞、失活的物質(zhì)的滅菌，如維生素。6.4.5.3干熱滅菌將待滅菌的器皿，用紙包好或放在特定的容器內(nèi)，置于烘箱中，在160左右保持2h。適用于培養(yǎng)皿等玻璃器皿的滅菌。6.4.6平板和斜面的制備在無菌條件下把冷卻至45左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，平板厚度范圍控制在3mm5mm。制備的斜面長度不超過試管長度的2/5。6.

7、5培養(yǎng)基合格檢驗6.5.1檢查固體培養(yǎng)基濕度。培養(yǎng)基冷凝水過多或干燥出現(xiàn)裂痕時，均不能使用。6.5.2隨機抽取已滅過菌的培養(yǎng)基放入2830培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，確定無菌生長后方可使用。6.6培養(yǎng)基存放培養(yǎng)基應(yīng)放在冰箱48保存。經(jīng)過存放的培養(yǎng)基使用前應(yīng)進(jìn)行6.5的合格檢驗，合格后方可使用。7微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途參見附錄A。 附錄A（規(guī)范性附錄）常用培養(yǎng)基配方A.1營養(yǎng)瓊脂A.1.1成分蛋白胨            

8、                          10.0 g牛肉膏                       &#

9、160;              3.0 g氯化鈉(NaCl)                                5.0 g瓊脂 

10、60;                                      18.0 g蒸餾水           

11、;                           1 000 mLpH                       

12、;                   7.27.5A.1.2配制要點將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.1.3用途適用于一般細(xì)菌培養(yǎng)和保藏。A.2芽孢桿菌培養(yǎng)基A.2.1成分蛋白胨               &

13、#160;                      5.0 g牛肉膏                          

14、0;           3.0 g土壤浸出液                                  250 mL蒸餾水    

15、                                  750mL瓊脂               

16、0;                        18. 0 g A.2.2配制要點土壤浸取液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補水至250mL。其他同A.1.2A.2.3用途適用于芽孢桿菌的保藏。A.3阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基A.3.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)      

17、0;                    0.2 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g氯化

18、鈉(NaCl)                                0.2 g碳酸鈣(CaCO3)               &

19、#160;               5.0 g甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g硫酸鈣(Ca

20、SO4·2H2O)                    0.1 g瓊脂                            &

21、#160;           18.0 g蒸餾水                                      1

22、000 mLpH                                          6.87.0A.3.2配制要點同A.1.2A.3.3用途用于固氮菌的培養(yǎng)。A.4根瘤菌培養(yǎng)

23、基YMA.4.1成分磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                    &

24、#160;     0.2 g氯化鈉(NaCl)                                0.1 g甘露醇(C6H14O6)        

25、0;                      10.0 g酵母膏                           

26、           1.0 g0.5%剛果紅溶液                              5 mL瓊脂       &#

27、160;                                18.0 g蒸餾水                 

28、60;                    1 000 mLpH                            

29、0;             6.87.0A.4.2配制要點將各種營養(yǎng)成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH后，加入剛果紅溶液。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.4.3用途適用于根瘤菌的培養(yǎng)。A.5根瘤菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN II A.5.1成分酵母粉                 &

30、#160;                    1.0 g甘露醇(C6H14O6)                           &

31、#160;   10.0 g土壤浸出液                                  200 mL瓊脂          

32、0;                             15.0 g蒸餾水                    

33、                  800 mL pH                               &#

34、160;          7.2A.5.2配制要點土壤浸出液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補水至200mL。其他同A.1.2A.5.3用途適用于根瘤菌的保藏和培養(yǎng)。A.6硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基A.6.1成分蔗糖（C12H22O11）                      

35、;        5.0 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)                   2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)               &#

36、160;          0.5 g碳酸鈣(CaCO3)                               0.1 g 三氯化鐵(FeCl3·6H2O)   

37、                     0.005 g瓊脂                            &#

38、160;           18.0 g蒸餾水                                      1 0

39、00 mLpH                                          7.58.0A.6.2配制要點先將三氯化鐵配制成5的溶液，按量加入，其他同A.1.2A.6.

40、3用途適用于硅酸鹽細(xì)菌的培養(yǎng)。A.7固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基A.7.1成分乳酸鈉（C3H5O3Na）                           10.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)          

41、0;          1.67 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.87 g氯化鈉(NaCl)        

42、0;                       0.05 g氯化鈣(CaCl2)                         

43、;      0.04 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.004 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)            

44、60;             0.1 g酵母膏                                    

45、  1.0 g瓊脂                                        18.0g蒸餾水       &

46、#160;                              1 000 mLpH                  &#

47、160;                       6.87.0A.7.2配制要點先將三氯化鐵配制成4的溶液按量加入，其他同A.1.2。A.7.3用途適用于莖瘤根瘤菌的培養(yǎng)。A.8馬丁培養(yǎng)基A.8.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)            &#

48、160;              1.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          10.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)  &#

49、160;                       0.5 g蛋白胨                          

50、;            5.0 g1%孟加拉紅水溶液                            3.3 mL氯霉素       

51、0;                              0.1 g瓊脂                   &#

52、160;                    18.0 g蒸餾水                            

53、0;         1 000 mLA.8.2配制要點將營養(yǎng)成分用蒸餾水溶解后，按量加入1%孟加拉紅水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培養(yǎng)基中。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.8.3用途適用于真菌的培養(yǎng)。A.9高氏合成一號瓊脂A.9.1成分硝酸鉀(KNO3)                   

54、60;            1.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)         &#

55、160;                0.5 g氯化鈉(NaCl)                                0.5

56、g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        0.01 g可溶性淀粉(C6H10O5)n                   

57、0;      20.0 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）                          0.1 g 瓊脂               

58、;                         18.0 g蒸餾水                        &

59、#160;         1 000 mLpH                                       &#

60、160;  7.27.4A.9.2配制要點淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀,加熱溶解后加入。再加瓊脂，加熱溶化后分裝，121高壓滅菌30min。重鉻酸鉀配制成溶液單獨滅菌，使用時再加入到培養(yǎng)基中。A.9.3用途適用于放線菌的培養(yǎng)。A.10聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基A.10.1成分D-葡萄糖酸鈉(C6H10NaO7)                       5.0 g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 

61、                          0.4 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                    

62、0.1 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g酵母膏                   &#

63、160;                  1.0 g氯化鈉(NaCl)                              

64、;  0.1 g氯化鈣(CaCl2)                               0.02 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)           

65、60;            0.01 g鉬酸鈉（Na2MoO4）                            0.002 g瓊脂      

66、0;                                 18.0 g蒸餾水                

67、                      1 000 mLpH                           &

68、#160;              6.87.0A.10.2配制要點將氯化鈣配、鉬酸鈉分別配制成2的溶液，按量加入，其他同A.1.2。A.10.3用途適用于固氮螺菌的培養(yǎng)。A.11馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基A.11.1成分馬鈴薯                    &#

69、160;                 200 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g瓊脂  &#

70、160;                                     18.0 g蒸餾水           

71、0;                          1 000 mLA.11.2配制要點稱取去皮馬鈴薯200g切塊，放入水中煮沸30min，然后用雙層紗布過濾取汁，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1000mL，115滅菌20min。A.11.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)。A.12麥芽汁瓊脂A.12.1成分12波林麥芽汁（Brix） 

72、60;                      1 000 mL瓊脂                          

73、0;            18.0 gpH                                     &

74、#160;    5.4A.12.2配制要點將麥芽汁調(diào)至12波林的糖度，調(diào)節(jié)pH，加入瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.12.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)和保藏。A.13乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）A.13.1成分蛋白胨                            &#

75、160;         10.0 g牛肉膏                                      10.0 g酵母膏 

76、                                     5.0 g檸檬酸氫二銨(NH4)2C6H6O7          

77、              2.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g吐溫80     

78、0;                                1.0 g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）              

79、;       5.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)              

80、0;           0.58 g硫酸錳(MnSO4·H2O)                           0.25 g瓊脂        

81、0;                               18.0 g蒸餾水                  

82、                    1 000 mLpH                             &

83、#160;            6.26.6A.13.2配制要點將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌20min。A.13.3用途適用于乳酸菌的培養(yǎng)。A.14光合細(xì)菌培養(yǎng)基 = 1 * ROMAN IA.14.1成分酵母粉                   

84、                   3.0 g蛋白胨                              

85、60;       3.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g氯化鈣（CaCl2）           

86、60;                 0.3 g蒸餾水                                

87、      1 000 mLpH                                          6.87.0A.14.2

88、配制要點同A.1.2。A.14.3用途適用于光合細(xì)菌的培養(yǎng)。 A.15光合細(xì)菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN IIA.15.1成分；溶液 = 1 * ROMAN I氯化鈣（CaCl2）                             75 mg乙酸鈉（CH3COONa）   

89、60;                      1.6 g煙酸                           &

90、#160;            40 mg氯化鈉(NaCl)                                1.5 g生物素   &

91、#160;                                  40 mg酵母膏              

92、0;                       2.0 g硫胺素                          &

93、#160;           40 mg氯化鎂(MgCl2)                               200 mg乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液  &#

94、160;            5 mL微量元素溶液                                1 mL蒸餾水    &

95、#160;                                 800mL溶液 = 2 * ROMAN II磷酸二氫鉀(KH2PO4)           &

96、#160;               600 mg磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.18 g蒸餾水        

97、60;                             200 mL將溶液 = 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II分別于121高壓滅菌15min，冷卻后將溶液 = 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II混勻。微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8&

98、#183;2H2O）        2.0 g硼酸（H3BO3）                                100 mg氯化鋅（ZnCl2）     

99、                        100 mg高鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）                    20 mg氯化銅（CuCl2）&#

100、160;                            10 mg硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                  

101、;      2.0 g氯化鈷（CoCl2·6H2O）                        100 mg氯化錳（MnCl2·4H2O）              

102、;          100 mg氯化鎳（NiCl2·6H2O）                        20 mg亞硒酸鈉（Na2SeO3）          &

103、#160;                                  1 mg蒸餾水               

104、;                       1 000 mL乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液:乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Na2）                  20.0 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)&#

105、160;                       20.0 g蒸餾水                         

106、0;            1 000 mLA.15.2配制要點乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液需要通氣過夜，維生素類物質(zhì)要過濾除菌后按量加入到培養(yǎng)基中。A.15.3用途適用于光合細(xì)菌的培養(yǎng)。A.16乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(用于大腸菌群初步發(fā)酵)A.16.1成分蛋白胨                  

107、60;                   20.0 g    豬膽鹽                          

108、0;           5.0 g    乳糖                                   &

109、#160;    10.0 g0.04%溴甲酚紫溶液                           25.0 mL    蒸餾水