融合蛋白表達實驗報告

1、基因構建與表達實驗報告實驗一 目的基因擴增與純化回收一、聚合酶鏈式反應實驗目的：通過PCR反應將目的片段擴增出來，獲得足量的目的片段。實驗原理：DNA雙螺旋在90-95解鏈形成單鏈；50-55引物與單鏈結合；70-72TaqDNA聚合酶從結合在模板上的引物出發(fā)，以dNTP為原料，按堿基配對方式，從53方向合成新的DNA鏈。經變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2的n次方倍。實驗儀器和材料：PCR儀 PCR管 移液器 tip槍頭實驗試劑： 雙蒸水（ddH2O） 10×PCR緩沖液(含Mg2) 4種10×dNTP 混合 Taq酶（Easy Taq）DNA模板兩種引物（上游和

2、下游） 實驗步驟：1、 配制PCR反應體系試劑ddH2OEasy Taq BufferdNTPEasy Taq酶甘油上游引物下游引物DNA模板100ul大體系6510100.210222注：一般情況下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配體系分裝到PCR管中（100ul/管），再加入對應的上下游引物和模板2、 放入PCR儀，按照實驗設計的溫度進行PCR，反應參數如下： (1) 94預變性4min； (2) 94變性1min； (3) 55退火1.5min； (4) 72 延伸2min； (5) 重復(2)-(4)30個循環(huán)；（6

3、）72 終延伸10min；二、瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗目的：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA分子量的大小，檢測目的基因片段是否擴增出來。實驗原理：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA在堿性溶液中帶有負電荷，在電場作用下朝正極移動。在瓊脂糖凝膠中電泳時，由于瓊脂糖凝膠具有一定孔徑，長度不同的DNA分子由于所受凝膠的阻遏作用大小不一，遷移的速度不同，從而可以按照分子量大小得到有效分離。溴化乙錠（EB）可插入到DNA分子的相鄰堿基之間，在紫外光的照射下出現熒光，從而指示DNA含量和位置。實驗儀器：電泳儀、 紫外檢測儀、 水平電泳槽、移液槍、 一次性手套實驗試劑： TAE 、EB溶液

4、、凝膠加樣緩沖液、 瓊脂糖實驗步驟：1、 1%瓊脂糖凝膠的制備（以制備5塊膠為例）：（1）稱取瓊脂糖1.6g，加入160ml 1 x TAE緩沖液，在微波爐上加熱溶解煮沸熔化，取出搖勻至無沉淀。（2）取有機玻璃內槽，放置于水平位置，用移液槍吸取少量膠將有機玻璃內槽兩端密封。冷卻到60左右（手感溫度不燙手即可）加入7ulEB溶液，搖勻后倒入有機玻璃內槽，等距插入5個樣品梳子。（3）冷凝后將梳子撥出，電泳膠放入電泳槽中，加入TAE電泳緩沖液沒過膠面。2、加樣用移液槍取緩沖液，依次點3ul緩沖液在點樣板上，再取PCR樣品溶液10ul左右與緩沖液混勻后，加入樣品孔中，并記錄好點樣順序。（大體系PCR產

5、物需要回收，點樣時更換槍頭避免交叉污染）3、電泳及結果觀察接通電泳槽與電泳儀的電源，170V恒壓電泳20min，電泳至溴酚藍接近膠底部邊緣即可；電泳完畢，取出凝膠，放在紫外燈下觀察DNA條帶的位置，根據DNA條帶與溴酚藍的相對位置估算DNA分子量大小，記錄結果。三、DNA片段回收：1、搖勻GS樹脂，用移液槍取500ul樹脂分裝于1.5mlEP管中，將PCR大體系產物加入到GS樹脂中，用移液槍吹打混勻，靜置10min，讓片段結合到GS樹脂上2、將混合液轉入純化柱中，13000rpm瞬時離心，棄收集管中液體3、加600ul80%異丙醇洗脫兩次，13000rpm瞬時離心，棄收集管中液體，13000r

6、pm空甩20min ；取出回收柱放入干凈的1.5mlEP管中，放入30-40攝氏度烘箱烘干10min左右，使異丙醇完全揮發(fā)。4、取出加入50ul ddH2O浸潤樹脂干粉，靜置10min讓ddH2O充分浸潤樹脂干粉， 13000rpm離心2-3min，得到的PCR產物用于雙酶切。實驗結果：序號引物號100ul大體系20ul小體系片段大小1P182793272P182803393P182813784P182823215P182835526P182842317P182852228P18286×3279P1828750110P18288××52811P1829047112

7、P1829135113P1829218614P1929364515P18295××87316P1829661217P1829724318P1829841719P1829990320P1830024921P1830228522P1830330023P1830430624P1830534525P1828918626P18274489實驗二 DNA雙酶切及酶切產物純化實驗目的：通過DNA限制性內切酶對DNA雙鏈進行雙酶切，使DNA片段露出相應的粘性末端。實驗原理：1、核酸限制性內切酶是在原核生物中發(fā)現的一類專一識別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，他們的功能類似動物的免疫系統(tǒng)

8、，用于抗擊外來DNA的侵襲，具有自我保護機制。一種限制性內切酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點上以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，切割DNA分子。在酶切反應中，DNA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg2+等因素均可影響酶切反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到完全酶切。2、型限制性核酸內切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，其優(yōu)點是：只具有限制性活性，無甲基化修飾活性；對DNA的切割要求嚴格的序列作為靶位點，切割精確；此類酶作用時只需要Mg2+參與，無需ATP。3、DNA雙酶切可有效防止載體自連形成空載體，雙酶切應選擇公用的Buffer實驗儀器和材料：PCR儀

9、、PCR管、移液槍、tip槍頭、限制性內切酶實驗步驟：取5ul通用酶切buffer Tango，加入1ul限制性內切酶1和1ul限制性內切酶2，將PCR回收產物全部（大約43ul）加入混勻，體系配好后蓋上PCR管并做好編號，放入PCR儀中，設定37酶切過夜。用含有GS結合液的樹脂純化酶切產物，操作方法同PCR產物回收方法。序號引物號酶切位點1酶切位點2Buffer1P18279EcoRXholTango2P18286EcoRXholTango3P18292EcoRXholTango4P18299EcoRXholTango5P18280BamhXholTango6P18281BamhXholTa

10、ngo7P18282BamhXholTango8P18283BamhXholTango9P18284BamhXholTango10P18285BamhXholTango11P18287EcorXholTango12P18290BamhXholTango13P18291BamhXholTango14P18293BamhXholTango15P18296BamhXholTango16P18297BamhXholTango17P18298BamhXholTango18P18300BamhXholTango19P18302BamhXholTango20P18303BamhXholTango21P183

11、04BamhXholTango22P18305BamhXholTango23P18289BamhXholTango24P18274BamhXholTango實驗三 目的基因與載體連接實驗目的：將外源 DNA 片段與線狀質粒載體連接，構建具有目的基因的質粒載體。實驗原理：在Mg2+和ATP存在下， DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復合物；酶-AMP復合物結合到相鄰的具有 5'磷酸和 3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化，形成一個新的磷酸二酯鍵，將切口封閉。實驗儀器與材料：PCR儀、

12、PCR管、移液槍、tip槍頭、T4連接酶Buffer、T4 DNA連接酶、pet-28a載體、pGEX-4T載體實驗步驟1、配制連接反應體系，按順序向微量PCR管中依次加入：10×T4連接酶buffer 1ulT4連接酶 1ulPEGX載體/PET28a載體 1ul純化后酶切產物 7ul2、體系配好后放置于PCR儀中，22保溫4h。第一批連接重組22個PGEX-4T E+X18279、18292、18299PGEX-4T B+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290pet28a E+X18279、18292、18299pet28

13、a B+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290第二批連接重組24個PGEX-4T B+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274pet28a B+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274實驗四 重組子轉化試驗目的: 將含有目的基因的重組質粒轉化入大腸桿菌中。試驗原理：細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫做感受態(tài)。細菌在0 CaCl2低滲

14、溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。細菌處于0 CaCl2低滲溶液中，外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽復合物粘附于細胞表面，經過42°C 90S熱擊處理，促進吸收DNA復合物。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質粒上所帶的抗藥性基因表達，即可在含Amp或Kan的培養(yǎng)基中生長。從而篩選出重組子，即帶有外源DNA分子的受體細胞。實驗儀器與材料：超凈工作臺、低溫離心機、恒溫搖床、恒溫箱、-80冰箱、恒溫水浴鍋胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉(Nacl)、氨芐青霉素、感受態(tài)DE3（BL21）、pet-28a載體、pGEX-4T載體、1.5mL離心管、移液槍、試管、

15、培養(yǎng)皿等試劑準備：（1） SOB培養(yǎng)基200ml：蛋白胨4g、酵母粉1g、NaCl 0.1g，加水定容至200ml，調節(jié) pH 7.0（2） LB固體培養(yǎng)基：1%NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.5%瓊脂粉，培養(yǎng)基放入121濕熱滅菌20min。（3）抗生素：卡那青霉素，氨芐青霉素實驗步驟：1、連接完成的重組質粒，在PCR儀中65滅活10min2、從-80冰箱中取2支感受態(tài)細胞，在酒精燈火焰下，分裝80ul感受態(tài)于1.5mlEP管中，并加入10ul重組質?；靹?，冰浴30分鐘。3、于42恒溫水浴鍋中熱激90s，迅速轉移至冰浴中，繼續(xù)冰浴5min4、每管加入800 ulSOB、16ul

16、Glu、4ulMgCl2，37 150rpm搖床培養(yǎng)50min。5、8000rpm離心5min，倒掉部分上清，在超凈工作臺中將吹打混勻后培養(yǎng)物涂布于含Amp或Kan的LB瓊脂平板上。6、在37培養(yǎng)箱中將平皿倒置，培養(yǎng)過夜12-16h。實驗結果：在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長的菌落即為含有pGEX-4T重組載體的大腸桿菌，在含卡那青霉素的培養(yǎng)基上生長的菌落即為含有pet-28a重組載體的大腸桿菌。兩批實驗連接的18304構建Amp和Kan抗性平板上均未長，可能是酶切錯誤導致。后重新PCR、酶切重連，轉化篩選呈陽性，但未表達。實驗五 重組子篩選和接種實驗目的：從單抗菌落中篩選出陽性克隆實驗原理：帶有

17、目的基因的單克隆菌落在，在高溫下（95）裂解釋放出目的基因的質粒，通過PCR擴增目的基因，從而達到檢測的目的。實驗儀器和材料：恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、 紫外檢測儀、水平電泳槽、移液槍、一次性手套、LB固體培養(yǎng)基、牙簽，PCR擴增試劑等實驗步驟：1、取相應抗性的平板，在平板上畫格子；配制PCR反應體系2、取出過夜培養(yǎng)的平板，每個菌篩選5個單克隆菌落在平板格子內畫線，畫線的牙簽放入配好的20ul體系中涮洗，涮洗過牙簽的體系放入PCR儀中進行擴增，畫線的平板放在37培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4h。3、PCR完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選結果。實驗結果：第一批篩選結果記錄序號引物號氨芐青霉素抗性卡那青

18、霉素抗性1P182793、4、51、2、42P182801、2、3、4、51、4、53P182811、4、5-4P182823、4、51、2、3、4、55P182831、3、4、5-6P182841、2、3、4、52、3、4、57P182851、2、3、51、2、3、48P182871、2、3、51、2、59P182901、3、4、52、3、4、510P182991、2、4、51、311P182921、2、3、4、54、5第二批篩選結果記錄序號引物號氨芐青霉素抗性卡那青霉素抗性1P182911、3、1、32P18293-2、43P182961、21、2、3、4、54P182973、41、25P

19、182984、52、36P183003、41、2、57P183022、3、4、52、3、48P183032、3、4、51、2、4、59P18304平板未長平板未長9P183052、32、3、4、510P18289-3、411P182741、2、3、4、51、2、3、4、5小樣接種挑取兩個陽性克隆菌落，接種于4ml液體LB抗性培養(yǎng)基中，37 220rpm搖床過夜培養(yǎng)，兩批接種信息如下：序號名稱序號名稱序號名稱序號名稱1+18279-3/-412+K18279-1/-21+18291-1/-312+K18291-1/-32+18280-1/-213+K18280-1/-42+18293-1/-21

20、3+K18293-2/-43+18281-1/-414+K18281-1/-23+18296-1/-214+K18296-2/-34+18282-3/-415+K18282-1/-24+18297-3/-415+K18297-1/-25+18283-1/-316+K18283-1/-25+18298-4/-516+K18298-2/-36+18284-1/-217+K18284-2/-36+18300-3/-417+K18300-1/-27+18285-1/-218+K18285-1/-27+18302-2/-318+K18302-2/-38+18287-1/-219+K18287-1/-28

21、+18303-2/-419+K18303-1/-29+18290-1/-320+K18290-2/-39+18305-2/-320+K18305-2/-310+18299-1/-221+K18299-1/-310+18289-1/-221+K18289-3/-411+18292-1/-222+K18292-4/-511+18274-1/-222+K18274-1/-2實驗結果：小樣接種菌生長良好，無未長現象。實驗六 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達與制樣實驗目的：檢測陽性克隆的表達情況實驗原理：1、Ecoli Lac操縱子包括Z、Y、A三個結構基因，以及啟動子P、控制子O、阻遏子I。LacI基因

22、編碼一種阻遏蛋白，其與操縱序列O結合，使基因表達處于關閉狀態(tài)。2、在沒有乳糖存在時，Lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，此時I序列在啟動子的作用下表達阻遏蛋白，并與O序列結合，抑制轉錄的起始；當有乳糖存在時，Lac操縱子即可被誘導，真正的誘導劑并非乳糖本身，乳糖進入細胞后，在-半乳糖苷酶作用下轉變?yōu)榘肴樘?，后者作為一種誘導劑結合阻遏蛋白，從而使RNA聚合酶能順利地與控制子結合并移動，使LacZ、Y、A基因得以表達。3、異丙基巰基半乳糖苷（IPTG），是一種乳糖類似物，因為不是半乳糖苷酶的底物，所以不能被細胞利用，從而實現持續(xù)表達。實驗儀器和材料：恒溫搖床、玻璃試管、超凈工作臺、低溫離心機、濕熱滅菌鍋、含

23、外源基因表達栽體的E.coli、酵母粉、胰化蛋白胨(tryptone)、氯化鈉(Nacl)、甘油、氨芐青霉素、卡那青霉素、IPTG、移液槍、tip槍頭實驗步驟：1、取200ul培養(yǎng)過夜的菌種，接種于新的4mLLB抗生素培養(yǎng)基中2、于37恒溫搖床，200r/min培養(yǎng)1.5h后，加入 30l IPTG ，繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時。3、取1.5ml菌液， 8000rpm，低溫離心5min，收集菌體棄上清，加入SDS Buffer100ul，用牙簽攪碎菌體，放在沸水中煮沸1.5-2h，于4°C冰箱中保存。實驗結果：擴大接種和誘導培養(yǎng)，無變清現象，菌體生長良好。實驗七 Western-blot檢測

24、表達蛋白實驗目的：蛋白經SDS-PAGE后進行Western-blot檢測，鑒定目的蛋白的表達情況實驗原理：1、SDS-PAGE電泳分離蛋白質，是基于各蛋白組分在凝膠中的遷移率主要取決于分子大小和形狀，及其所帶電荷的多少。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS，SDS與蛋白分子結合，使其帶上相同密度的負電荷，其數量遠遠超過蛋白分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同蛋白質間原有的電荷差異，因而蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于分子量大小。2、Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白質，利用抗體作為“探針”，用二抗標記“顯色”。經過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（

25、例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測目的基因表達的蛋白成分。實驗步驟：一、SDS-PAGE電泳1.配制分離膠配制12%和14%分離膠 按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤夯煸谝粋€50ml的小燒杯中：凝膠濃度（%）1214分離膠buffer4ml4ml40%gel2ml2.2ml雙蒸水2ml1.8mlTEMED8ul8ul10%Aps80ul80ul總體積8ml8ml不同濃度的凝膠的成分和用量 根據被分

26、離的外源蛋白的相對分子量選擇凝膠濃度，先洗凈玻璃架好制膠架，裝滿水靜置一段時間，不漏水為宜；將所有成分混勻后加入兩玻璃夾縫中，膠面離小玻璃上端1cm左右，并小心在膠面上加入1cm蒸餾水，約30min等膠自然凝聚后傾斜倒出蒸餾水瀝干。2.4%濃縮膠的配置 按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤夯煸谝粋€50ml的小燒杯中：4 %分離膠的配制成分成分用量壓縮膠buffer1.5ml40%gel0.3ml雙蒸水1.2mlTEMED4ul10%Aps40ul總體積3ml混勻后，立刻轉移到玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平，并在兩玻璃夾縫中快速斜插入15孔的梳子，溶液凝固后小心拔出梳子。3.上樣 氨芐抗性加

27、10ul，卡那抗性加15ul，marker加樣量隨樣。4.電泳 接好電極，將電壓調至80V，待溴酚藍移到分離膠后（約20min），在將電壓調至120V，當溴酚藍移到玻璃距底部即將全部跑出時切斷電源，總用時大約90min。二、轉膜（1）將上層濾紙、下層濾紙分開浸泡于transfer buffer中，用鑷子將編號的PVDF膜放在甲醇中浸潤2-3min后浸泡在transfer buffer中。（2）在半干轉移儀陽極面鋪好下層濾紙；將膜鋪在下層濾紙上，不要產生氣泡，倒少量Buffer于膜上，保持膜的濕潤；將膠取出，切掉上層膠，小心將膠鋪在膜上，趕走氣泡；將上層濾紙覆蓋在膠上，按住一端，用滾輪趕走多余的

28、液體。（注意濾紙與膜、膜與膠之間不能有氣泡）（3）蓋上電極蓋子，接通電源，每張膜恒流60mA，轉移40min。三、蛋白印跡1、封閉位點 轉移結束前配好5%TBST牛奶，轉移完畢后將膜放入甲醇浸泡，然后晾干使膜完全疏水2、加一抗孵育 每個盒子放兩張膜，背面相貼而放，加30ml5%TBST牛奶封閉位點，按1:8000加GST、His抗體孵育1h3、洗滌 孵育完后，用TBST快洗三次，再在轉搖床洗5次，每次5min，洗掉牛奶。4、DAB顯色 取一管DAB加入15ul過氧化氫，將洗滌后的膜放入染色10min左右5、用自來水清洗膜數次后，晾干觀察。實驗結果：第一批連接Western-blot結果圖182

29、79-4 K18279-118280-1 K18280-118282-3 K18282-118283-1 K18283-118284-1 K18284-218285-1 K18287-218290-1 K18290-318299-1 K18299-118292-1 18287-1質粒轉Rose呈陽性第二批連接Western-blot結果圖 重連Western-blot結果圖18293-2 K18293-2 18287-118296-2 K18296-2 18291-118298-4 K18298-2 18297-118300-4 K18303-1 K18289-118274-2 K18274-

30、1 18303-118289-1 18286-118305-2膜1膜2泳道上樣信息上樣量分子量kDa結果上樣信息上樣量分子量kDa結果118279-310ul38×18287-110ul45×2-410ul38偏高-210ul45×3Marker10ulMarkerMarker18290-110ul44418280-110ul39Marker10ulMarkerMarker5-210ul39-310ul44618281-110ul41×18299-110ul607-410ul41×-210ul60818282-310ul3818292-110u

31、l339-410ul38×-210ul33×1018283-110ul4718227-310ul3711-310ul4718151-110ul371218284-110ul3418170-110ul3413-210ul3418176-110ul37×1418185-110ul34偏高15-210ul34偏高膜3膜4泳道上樣信息上樣量分子量kDa結果上樣信息上樣量分子量kDa結果1K18279-110ul18K18287-110ul252-210ul18-210ul253K18280-110ul19K18290-210ul244-410ul19-310ul245Ma

32、rker10ulMarkerMarkerK18299-110ul406K18281-110ul21×Marker10ulMarkerMarker7-210ul21×-310ul408K18282-110ul1818292-410ul13×9-210ul18×-510ul13×10K18283-110ul27K18176-210ul17偏低11-210ul2712K18284-210ul1413-310ul1414K18185-110ul14×15-210ul14×第一批Western-blot結果記錄膜1膜2泳道上樣信息上樣

33、量分子量kDa結果上樣信息上樣量分子量kDa結果118291-110ul40×18303-210ul372-310ul40×-410ul373Marker10ulMarkerMarker18305-210ul38418293-110ul49GSTMarker10ulMarkerMarker5-210ul49-310ul38×618296-110ul4818289-110ul337-210ul48-210ul33818297-310ul35×18274-110ul449-410ul35×-210ul441018298-410ul4118176-1

34、10ul37×11-510ul41K7227-110ul43×1218300-310ul35-210ul43×13-410ul351418302-210ul37×15-310ul37×膜3膜4泳道上樣信息上樣量分子量kDa結果上樣信息上樣量分子量kDa結果1K18291-110ul20×K18303-110ul172-310ul20×-210ul173K18293-210ul29K18305-210ul18×4-410ul29-310ul18×5Marker10ulMarkerMarkerK18289-3

35、10ul13×6K18296-210ul28Marker10ulMarkerMarker7-310ul28-410ul13×8K18297-110ul15×K18274-110ul249-210ul15×-210ul2410K18298-210ul2111-310ul2112K18300-110ul15×13-210ul15×14K18302-210ul17×15-310ul17×第二批Western-blot結果記錄實驗八 質粒的提取與鑒定實驗目的：掌握堿裂解法抽提質粒DNA的原理及各種試劑的作用，并對所提質粒進

36、行PCR鑒定實驗原理：微量堿裂解抽提質粒，是基于染色體DNA與質粒DNA變性與復性的差異。在pH 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。當以高鹽緩沖液調節(jié)pH至中性時，質粒DNA復性保留在溶液中，而大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，通過離心形成沉淀去除。然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。實驗儀器及材料：含有質粒的大腸桿菌菌液、離心機、移液器、質粒小提試劑盒（用前溶液加入RNA酶混勻）實驗步驟: 一、提取質粒1、將50ul菌液接種到6ml含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基

37、中37震蕩培養(yǎng)過夜；2、取2ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，10000r/min離心2min；3、重復步驟2一次，倒去去培養(yǎng)液，吸干，使細胞沉淀盡可能干燥；4、加250l溶液，旋渦震蕩懸浮菌體，加250l的溶液，輕輕上下顛倒混勻，不超過5 min。 加350l的溶液，輕輕上下顛倒混勻，室溫放置5 min。5、13000r/min，離心20min，將上清轉至純化柱中13000rpm瞬時離心。6、向純化柱中加50ulHBC，13000r/min，離心1min，棄下清液。7、加700ul的DNA Wash Buffer，13000r/min，離心1min，棄下清液。8、重復步驟8一次。13000r/mi

38、n，空轉離心2min，取出柱子放在干凈的1.5mlEP管中，放在烘箱里面烘10min。9.加50ul雙蒸水在濾膜上，室溫下靜置2min，13000r/min，離心1min，收集的質粒放在-20冰箱中保存。二、質粒鑒定（PCR）體系同PCR小體系，鑒定結果為陽性的質粒為：18279-4 K18279-1 18293-2 K18293-2 18287-118280-1 K18280-1 18296-2 K18296-2 18291-118282-3 K18282-1 18298-4 K18298-2 18297-118283-1 K18283-1 18300-4 K18303-1 K18289-1

39、18284-1 K18284-2 18274-2 K18274-1 18303-118285-1 K18287-2 18289-1 18286-118290-1 K18290-3 18305-218299-1 K18299-118292-1實驗總結及結果討論一、 實驗總結考核實驗共擴增引物號26個，陽性24個；連接轉化分兩批進行，第一批連接重組22個，表達呈陽性且質粒鑒定正確的有17個，第二批連接重組24個，表達呈陽性且質粒鑒定正確的有12個，后期改變條件重連21個，表達呈陽性且質粒鑒定正確的有6個；考核實驗最終給菌35個。二、 結果與討論1. 基因擴增（PCR）：實驗結果：第一批PCR大體系

40、擴增26個引物號，結果呈陽性的23個，陰性3個分別是P18286、P18288、P18295；后改用20ul小體系重新擴增P18286、P18288、P18295，結果只有P18286呈陽性，并取P18286小體系PCR產物5ul作為模板擴增100ul大體系，結果仍為陽性。原因分析：大體系與小體系試劑配比基本相同，不同的是上下游引物和模板的相對量，20ul小體系上下游引物和模板分別加1ul，比大體系的相對量多，因此PCR效率較高；P18288、P18295 PCR呈陰性，可能是模板的問題（濃度不夠含量較低、含雜蛋白等抑制物）、PCR反應條件的問題（退火溫度高影響引物與模板的結合、延伸時間太短）、靶序列發(fā)生突變或缺失影響引物與模板特異性結合、引物設計不合理，與模板結合的特異性較差。改進措施：第一次PCR結果為陰性時，首先核對所用模板是否正確；可以嘗試先擴增小體系，以小體系為模板擴增100ul大體系；降低引物量，適當增加模板用量，對模板進行純化；適當降低退火溫度，增加延伸時間；必要時重新設計引物，更換更保守、特異性更高的引物。2.連接重組與轉化實驗結果：大部分轉化菌在相應抗性平板上生長良好，菌落數能達到要求；其中18304在兩次的連接轉化后，Amp和Kan抗性平板均未長，后重做PCR、酶切后再次連接，轉化后Amp和Kan