雙特異性抗體及其應(yīng)用

1、雙特異性抗體及其應(yīng)用Gaowei Fan, Zujian Wang, Mingju Hao and Jinming Li摘要：雙特異性抗體(BsAbs)可以識(shí)別兩個(gè)不同的抗原表位。這種雙重特性為其開辟了廣闊的應(yīng)用前景，包括招募T細(xì)胞重定向腫瘤細(xì)胞，同時(shí)阻斷兩個(gè)不同的信號(hào)通路，對不同疾病介質(zhì)的雙重錨定和傳遞特定藥物到目標(biāo)位點(diǎn)。catumaxomab(抗EpCAM和CD3)和blinatumomab(抗CD19和CD3)的獲批成為bsAbs發(fā)展的一個(gè)重要里程碑。目前，已開發(fā)出超過60種不同的bsAb型式，其中部分已進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)。本文總結(jié)了不同的bsAbs型式及其臨床應(yīng)用，揭示了優(yōu)化設(shè)計(jì)bsAbs

2、的策略。關(guān)鍵字：雙特異性抗體， BiTE， 癌癥，型式， Catumaxomab，診斷縮寫ADCC抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用DNLdock-and-lockADCP抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用IgG免疫球蛋白GALL淋巴細(xì)胞白血病mAb單克隆抗體BACE1-site APP-cleaving酶1MPM惡性胸膜間皮瘤BiTE雙特異性T細(xì)胞銜接器NHL非霍奇金淋巴瘤BsAb雙特異性抗體NSCLC非小細(xì)胞肺癌CDC補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性scFv單鏈FvDARTs雙親和重定向分子TandAbs串聯(lián)雙抗體Wet AMD濕型年齡相關(guān)性黃斑變性1 背景目前，有44個(gè)基于單克隆抗體(mA

3、b)的產(chǎn)品在市上銷售，2013年全球銷售總額大約為750億美元1。治療性抗體已經(jīng)成為癌癥、自身免疫、炎癥和各種其他疾病患者的主要選擇藥物2， 3。然而，單克隆抗體有幾個(gè)局限性。病人接受mAb治療可能產(chǎn)生耐藥性或無應(yīng)答4。癌癥和其他疾病是多因素疾病，有多種信號(hào)通路參與疾病發(fā)生。單一靶點(diǎn)的免疫療法似乎并不足以摧毀癌細(xì)胞。雙特異性抗體(BsAbs) 作為潛在的癌癥治療藥物已提出了幾十年，但直到最近才開始結(jié)出果實(shí)。BsAbs有幾個(gè)優(yōu)勢5:(1)bsAbs可以將特定的免疫細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞以增強(qiáng)對腫瘤的殺傷力，(2)bsAbs可以同時(shí)阻斷兩種不同介質(zhì)/通路而發(fā)揮獨(dú)特的或重疊的功能(3)bsA

4、bs與兩種不同的細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，相對而言可能潛在的增加結(jié)合特異性。制造方面的問題一直以來困擾著BsAbs的開發(fā)，如產(chǎn)品不穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)量低、會(huì)產(chǎn)生免疫原性等6。新型式的bsAbs更穩(wěn)定、更容易生產(chǎn)以及更少的免疫原性使BsAbs的開發(fā)已經(jīng)成為了可能。目前，超過30個(gè)bsAbs處于臨床開發(fā)階段，更有兩個(gè)先驅(qū)者已上市(表1)。表1 臨床試驗(yàn)中的雙特異性抗體 (https:/ )雙抗類型靶點(diǎn)機(jī)理公司階段適應(yīng)癥CatumaxomabTriomabEpCAM，CD3T細(xì)胞的招募，F(xiàn)c介導(dǎo)效應(yīng)器功能Neovii 歐盟批準(zhǔn)EpCAM陽性腫瘤惡性腹水AGO Study Gr

5、oup完成II期，NCT00189345鉑難治性卵巢上皮癌AIO-Studien-gGmbHII期，NCT01504256胃腺癌Grupo Español de Investigación en Cáncer de OvarioII期，NCT01246440卵巢癌Gustave RoussyII期，NCT01784900胃腹膜癌擴(kuò)散ErtumaxomabTriomabHER2，CD3T細(xì)胞的招募，F(xiàn)c介導(dǎo)效應(yīng)器功能Krankenhaus NordwestI/II期，NCT01569412Her2 / Neu陽性晚期實(shí)體瘤FBTA05TrioMabCD20，CD3T

6、細(xì)胞招募慕尼黑技術(shù)大學(xué)I/II期，NCT01138579白血病BlinatumomabBiTECD3，CD19T細(xì)胞招募安進(jìn)(慕尼黑) 美國批準(zhǔn)淋巴細(xì)胞白血病I期，NCT00274742復(fù)發(fā)非霍奇金淋巴瘤II期，NCT01207388B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病II期，NCT01209286復(fù)發(fā)/難治性淋巴細(xì)胞白血病National Cancer InstituteII期，NCT02568553非霍奇金淋巴瘤II期，NCT02143414成人b淋巴細(xì)胞白血病t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1;未經(jīng)治療的成人淋巴細(xì)胞白血病III期，NCT02003222BCR-ABL陰性B淋巴細(xì)胞

7、白血病Solitomab(MT110，AMG 110)BiTECD3，EpCAMT細(xì)胞招募安進(jìn)(慕尼黑) I期完成，NCT00635596實(shí)體腫瘤AMG 330BiTECD33，CD3T細(xì)胞招聘安進(jìn)I期，NCT02520427復(fù)發(fā)/難治性非霍奇金淋巴瘤MT112(BAY2010112)BiTEPSMA， CD3T細(xì)胞招聘拜耳I期，NCT01723475前列腺腫瘤MT111(MEDI- 565)BiTECEA，CD3T細(xì)胞招聘MedImmune LLCI期完成，NCT01284231胃腸道腺癌BAY2010112BiTECD3，PSMAT細(xì)胞招聘拜耳I期，NCT01723475前列腺腫瘤MDX4

8、472(Fab)交聯(lián)CD64,EGFR激活單核細(xì)胞殺死腫瘤Dartmouth-Hitchcock醫(yī)療中心I期完成，NCT00005813大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤TF2Dock and lockCEA,HSG 酶聯(lián)免疫吸附檢測新澤西州癌癥中心分子醫(yī)學(xué)和免疫中心I期，NCT00895323結(jié)腸直腸癌放射免疫療法Centre René GauducheauI / II期，NCT01221675小細(xì)胞肺癌Immuno-PET南特大學(xué)醫(yī)院I / II期，NCT01730638復(fù)發(fā)甲狀腺髓樣癌Immuno-PET南特大學(xué)醫(yī)院I / II期，NCT01730612HER2陰性乳腺癌表達(dá)CEA放射免疫

9、療法內(nèi)梅亨大學(xué)I期完成，NCT00860860結(jié)直腸腫瘤rM28串聯(lián)scFvCD28，HMV-MAA自體淋巴細(xì)胞重靶向腫瘤圖賓根大學(xué)醫(yī)院I / II期，NCT00204594惡性黑色素瘤HER2Bi-aATCT細(xì)胞預(yù)裝bsAbsCD3，HER2激活T細(xì)胞Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI期，NCT02470559卵巢、輸卵管或原發(fā)性腹膜癌GD2Bi-aATC1877509T細(xì)胞預(yù)裝bsAbsCD3，GD2激活T細(xì)胞Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI / II期，NCT02173093兒童和年輕人神經(jīng)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤

10、I期完成，NCT00938626多發(fā)性骨髓瘤和漿細(xì)胞腫瘤I期完成，NCT00244946非霍奇金淋巴瘤EGFRBi-aATCT細(xì)胞預(yù)裝bsAbsCD3，EGFR自體激活T細(xì)胞EGFR陽性腫瘤Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI / II期，NCT02521090成年人大腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;復(fù)發(fā)成人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤MGD006DARTCD123，CD3T細(xì)胞重靶向腫瘤MacroGenicsI期，NCT02152956復(fù)發(fā)/難治性急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）MGD007DARTgpA33，CD3T細(xì)胞重靶向腫瘤MacroGenicsI期，NCT02248805結(jié)直腸癌M

11、GD010DARTCD32B，CD79BMacroGenicsI期，NCT02376036健康受試者Anti-CEA×anti-DTPAscFv-IgGCEA，di -DTPA- 131I放射免疫療法南特大學(xué)醫(yī)院II期完成，NCT00467506甲狀腺髓樣癌DT2219ARL2 scFv偶聯(lián)白喉毒素CD19，CD22蛋白毒素靶向腫瘤共濟(jì)會(huì)癌癥中心I期，NCT00889408白血病，淋巴瘤I / II期，NCT02370160復(fù)發(fā)或難治性B系白血病或淋巴瘤IMCgp100ImmTACCD3，gp100T細(xì)胞招募Immunocore I期，NCT01211262惡性黑色素瘤I期，NCT0

12、2570308葡萄膜黑色素瘤Indium-labeled IMP - 205 xm734不清楚CEA，內(nèi)標(biāo)記肽核成像內(nèi)梅亨大學(xué)I期，NCT0018508結(jié)腸直腸癌LY3164530OrthoFab-IgGMET，EGFR阻斷2個(gè)受體禮來I期，NCT02221882腫瘤;腫瘤轉(zhuǎn)移OMP- 305883DVD-IgDLL4，VEGF2配體失活OncoMedI期，NCT02298387晚期固體惡性腫瘤REGN1979不清楚CD20，CD3T細(xì)胞招募Regeneron制藥I期，NCT02290951CD20 陽性B細(xì)胞惡性腫瘤COVA322IgG-fynomerTNF-，IL17A兩種炎癥因子阻斷Co

13、vagenI / II期，NCT02243787斑塊性銀屑病RG7802CrossMabCEA，CD3T細(xì)胞招聘羅氏公司I期，NCT02324257固體腫瘤RG7813(RO6895882)ScFv-IgGCEA，IL2的細(xì)胞因子羅氏公司I期，NCT02004106晚期和/或轉(zhuǎn)移性固體CEA陽性腫瘤RG7221(RO5520985)CrossMAbAng-2，VEGF2配體失活羅氏公司II期，NCT01688206腫瘤RG7716CrossMAbVEGF，Ang-22配體失活羅氏公司II期，NCT02484690濕性AMDMM - 111HAS bodyHER2， HER3阻斷兩個(gè)受體梅里馬克

14、制藥I期完成，NCT01097460乳腺腫瘤I期完成，NCT00911898her2擴(kuò)增實(shí)體腫瘤MM - 141scFv-IgGIGF-IR，HER3阻斷兩個(gè)受體梅里馬克制藥I期，NCT01733004肝細(xì)胞癌II期，NCT02399137胰腺癌MOR209 / ES414scFv-IgGPSMA， CD3T細(xì)胞招募緊急產(chǎn)品開發(fā)西雅圖LLCI期，NCT02262910前列腺癌TargomiRs不清楚EGFR，EDV傳遞納米粒子悉尼大學(xué)I期，NCT02369198反復(fù)惡性胸膜間皮瘤（MPM）和非小細(xì)胞肺癌MSB0010841NanobodyIL-17A / F阻斷2炎癥因子德國默克制藥公司I期，

15、NCT02156466牛皮癬alx - 0061NanobodyIL-6R，HSA阻斷炎癥因子，結(jié)合HSA增加半衰期AblynxI / II期完成，NCT01284569類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Ozoralizumab(atn - 103)NanobodyTNF，HSA阻斷炎癥因子，結(jié)合HSA增加半衰期AblynxII期完成，NCT01063803類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎AFM13TandAbCD30，CD16A激活NK細(xì)胞科隆大學(xué)II期，NCT02321592復(fù)發(fā)或難治性霍奇金淋巴瘤AFM11TandAbCD30，CD19重定向的T細(xì)胞Affimed GmbHI期，NCT02106091復(fù)發(fā)和/或耐火CD19陽

16、性 B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤SAR156597scFv-IgGIL4，IL13阻斷炎癥因子賽諾菲安萬特I / II期完成，NCT01529853突發(fā)性肺纖維化II期，NCT02345070突發(fā)性肺纖維化BsAbs主要是由三種方法制成7：(1)細(xì)胞雜交瘤技術(shù)是基于兩種不同的雜交瘤細(xì)胞系的細(xì)胞融合，(2)化學(xué)結(jié)合，包括化學(xué)交聯(lián)，(3)利用DNA重組技術(shù)的遺傳學(xué)方法。這些技術(shù)革新了bsAbs的開發(fā)，滿足特定應(yīng)用的各種類型BsAbs被開發(fā)出來，其中部分在本文中進(jìn)行了討論。2 BsAb類型BsAbs大致可以分為兩類：免疫球蛋白G(IgG)樣分子和非IgG樣分子(圖1)。IgG樣BsAbs保留F介導(dǎo)效應(yīng)功能，

17、如抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴細(xì)胞吞噬作用(ADCP)6。BsAbs的Fc區(qū)域使純化變得容易，同時(shí)提高了抗體的溶解性和穩(wěn)定性。IgG樣類型的BsAbs由于他們分子結(jié)構(gòu)較大以及FcRn介導(dǎo)的回收作用，因而具有更長的半衰期8。非IgG樣BsAbs由于分子結(jié)構(gòu)較小，使其獲得了更強(qiáng)的組織滲透力8。圖1 雙特異性抗體分子類型2.1 IgG樣類型2.1.1 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞技術(shù)依賴于融合兩個(gè)截然不同的雜交瘤細(xì)胞。Ig的重鏈和輕鏈隨機(jī)配對就產(chǎn)生了bsAbs9。在這個(gè)過程中，同時(shí)也生成了非功能性抗體。采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)的BsAbs與傳統(tǒng)的抗體相似。Catu

18、maxomab，第一個(gè)獲批的bsAb，就是由老鼠/小鼠雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的。2.1.2 Knobs-into-holes生產(chǎn)帶Fc片段的bsAbs會(huì)帶來一些挑戰(zhàn)，如生成不希望出現(xiàn)的同型二聚體或其他一些錯(cuò)配的雜質(zhì)分子?！発nobs-into-holes”方法通過在一個(gè)抗體的CH3區(qū)域用大分子氨基酸替換掉小分子氨基酸形成“knob”，同時(shí)在另一個(gè)抗體中采用相反的方式處理形成“hole”，二者結(jié)合后形成雜合抗體，采用此方法就可以解決Fc部分錯(cuò)配問題10。從理論上講，任何兩個(gè)不同的抗體都可以采用“knobs-into-holes”方法形成異型二聚體。然而，“輕鏈錯(cuò)配”又帶來了另一個(gè)挑戰(zhàn)。為了避免這個(gè)問題

19、，人們又提出了幾種解決方法：A）采用共有輕鏈生成bsAbs 11。然而，在這個(gè)策略中，結(jié)合特異性受限制且不是對所有bsAbs都適用。B）在不同的菌體中分別表達(dá)一半的“knob”和“hole”。這種方法可以避免輕鏈錯(cuò)配。然而，在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)會(huì)導(dǎo)致失去關(guān)鍵的糖基化修飾，這可能影響抗體效應(yīng)器功能（如抗體依賴細(xì)胞毒性由糖基與Fc受體結(jié)合后誘導(dǎo)產(chǎn)生）12。C）結(jié)合CrossMab和knobs-into-holes策略來將錯(cuò)配減到最低程度。在CrossMab抗體中，將重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域與輕鏈相應(yīng)的CL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行交換，以促使輕鏈正確配對13。采用knobs-into-holes和CrossMab策略，羅氏

20、制成了針對Ang-2和VEGFA的雙特異抗體A2V CrossMab14。D) 在VH-VL和CH1-CL之間引入額外的突變。這些突變促使重鏈優(yōu)先與輕鏈結(jié)合15。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，它需要在抗體保守區(qū)進(jìn)行大范圍的突變。2.1.3 雙可變結(jié)構(gòu)域Ig(Dual-variable domains Ig, DVD-Ig)兩個(gè)單克隆抗體的可變區(qū)采用串聯(lián)的方式融合在一起形成一個(gè)雙特異性IgG樣分子16。DVD-Ig的每個(gè)Fab都能與兩個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合。從理論上講，任何一對單克隆抗體都可以用于制成一個(gè)DVD-Ig分子。由此產(chǎn)生的特定抗體可以進(jìn)一步修飾以改變其結(jié)合價(jià)和特異性。該技術(shù)避免了不同重鏈和輕鏈間的錯(cuò)配，同時(shí)

21、也能提高產(chǎn)品的產(chǎn)量、均一性和穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)c區(qū)還有利于純化。然而，有一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)，靠里面的可變區(qū)親和力可能會(huì)變?nèi)?7。2.1.4 IgG-單鏈抗體(IgG -scFv)將一個(gè)單鏈抗體或單獨(dú)一個(gè)可變區(qū)結(jié)構(gòu)融合到輕鏈或重鏈的末端形成IgG-scFv。這種類型的抗體也包含在DVD-Igs內(nèi)。2.1.5 二合一（two-in-one）或雙功能Fab（DAF）抗體DAF抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠識(shí)別雙抗原18。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，首先需要確定一個(gè)能結(jié)合目標(biāo)抗原的模板抗體。然后通過對抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變以識(shí)別第二抗原。接下來的工作是進(jìn)一步抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙親和力。然而，二合一抗體也不能同時(shí)結(jié)合兩種不同的抗原（

22、抗原表位）。2.1.6 半分子交換（Half-molecule exchange）人類血清中，IgG4可以進(jìn)行半分子交換，這促使了可稱為“半分子交換”的IgG4 bsAbs構(gòu)建策略的誕生。在IgG1 CH3部位引入點(diǎn)突變后，IgG1抗體可以在可控的條件下進(jìn)行半分子交換而形成bsAbs19。這種策略也適用于人類的IgG2和IgG3。這種方法的最重要的優(yōu)點(diǎn)是可以先分別表達(dá)親代IgGs，然后通過調(diào)控形成不同的子代bsAbs。因此，該方法可以簡便的在短期內(nèi)制備大量bsAbs。此外，采用半分子交換形成的bsAbs保持了抗體的天然結(jié)構(gòu)，免疫原性低。2.1.7 -抗體一條重鏈和兩條具有不同結(jié)合特異性的輕鏈(

23、和)可以在一個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)。這樣，可以在同一個(gè)重鏈上結(jié)合和輕鏈，從而制成bsAbs20，然后由高度選擇性親和樹脂純化。-抗體的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的：首先，bsAbs未經(jīng)修飾，保留完整的人IgG型式；其次，bsAbs可以很容易的從抗體混合物中純化出來；第三，bsAbs可以以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)；最后，純化平臺(tái)可以應(yīng)用于所有-body，從而可以并行開發(fā)不同的bsAbs20。2.2 非IgG樣類型2.2.1 基于單鏈抗體的bsAbs （scFv-based bsAbs）單鏈抗體僅由用于結(jié)合抗原的VL和VH兩部分組成。通過修改鏈接區(qū)長度、抗體序列和外部因素，ScFvs可被制成二聚體、三或四聚體21。與正常Ig

24、G分子相比，scFvs具有更高的腫瘤特異性和組織滲透力；因此，基于單鏈抗體的 bsAbs備受青睞，并有幾個(gè)可能應(yīng)用于臨床。 串聯(lián)單鏈抗體兩個(gè)單鏈抗體通過一個(gè)靈活的連接肽如甘氨酸-絲氨酸重復(fù)基序連接起來形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)7。采用短連接肽可防止VH和VL結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)鏈見配對。采用長連接肽則可使抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠自由旋轉(zhuǎn)。著名的雙特異性T細(xì)胞連接器(BiTE)技術(shù)就是基于這種格式的。 雙價(jià)抗體型式（Diabody）在雙價(jià)抗體結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)不同抗體的可變區(qū)分別由兩個(gè)連接肽連接起來。第一個(gè)抗體的VH與第二個(gè)抗體的VL相連，同時(shí)第一個(gè)抗體的VL和第二個(gè)抗體的VH相連。兩個(gè)連接肽增加了抗體

25、的穩(wěn)定性。然而，這兩個(gè)連接肽也限制了抗原結(jié)合位點(diǎn)的移動(dòng)性，從而限制了抗原的識(shí)別。 單鏈雙價(jià)抗體雙價(jià)抗體型式可以通過鏈間增加一段連接肽制成單鏈雙價(jià)抗體。 串聯(lián)雙價(jià)抗體(TandAbs)當(dāng)兩對VL和VH通過一個(gè)單鏈連接起來后，制成一個(gè)四價(jià)TendAb。 雙親和重靶向分子（DARTs）DARTs是將第一個(gè)可變區(qū)的VH與第二條鏈的VL連接，同時(shí)將第二可變區(qū)的VH與第一條鏈的VL連接形成一個(gè)VLA-VHB+VLB-VHA型式的復(fù)合物22。鏈間引入二硫鍵來增加抗體的穩(wěn)定性22。DARTs由于尺寸較小導(dǎo)致其容易被機(jī)體清除。為了避免這種情況，MacroGenics在D

26、ARTs上融合了一個(gè)Fc片段以延長其血清保留時(shí)間23。2.2.2 納米抗體（Nanobodies）納米抗體是天然形成的最小的抗體，它只有重鏈部分（15kDa)24。納米抗體可以在缺少輕鏈的情況下與相應(yīng)的抗原結(jié)合。來自美洲駝和駱駝的具有不同結(jié)合特異性的納米抗體已經(jīng)被短鏈連接起來形成bsAbs25。2.2.3 Dock-and-lock(DNL)方法將抗體片段與異型二聚化蛋白（如cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）和A激酶結(jié)合蛋白（AKAP）進(jìn)行融合。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成異型二聚體后，就行成了雙特異性抗體26。2.2.4 其它雙特異性或多特異性分子ScFvs還可以連接到其他分子如細(xì)胞因子TNF-（天然的TNF

27、-以三聚物的形式存在）、膠原蛋白XV或XVIII的三聚結(jié)構(gòu)、拉鏈二聚作用域(Fos或Jun)來生成多價(jià)分子6。2.3 延長半衰期策略基于單鏈抗體的bsAbs有很多優(yōu)勢，比如易于制造，組織滲透力強(qiáng)，此外，他們還可以與完整抗體因空間位阻不能結(jié)合的抗原表位進(jìn)行結(jié)合。進(jìn)一步說，他們因缺少Fc區(qū)域而具有更低的免疫原性，從而避免被FcR所吸收。但是，基于單鏈抗體的bsAbs由于其半衰期短也導(dǎo)致了幾個(gè)缺點(diǎn)，如血液清除快、fast offrates和針對靶點(diǎn)（如腫瘤）保留時(shí)間短。在臨床應(yīng)用中，血清半衰期短的藥物需增加給藥頻率和量27。因此，延長血清半衰期在經(jīng)濟(jì)和治療兩方面都有益。有幾種策略可以延長bsAbs的

28、血清半衰期，如:2.3.1 聚乙二醇化附加高度靈活、親水的分子如PEG可以增加bsAbs的體積，從而提高他們的血清半衰期。然而，附加PEG的數(shù)量和尺寸鏈會(huì)導(dǎo)致抗體部分失活或親和力降低28。定點(diǎn)結(jié)合一個(gè)單鏈PEG鏈的方式似乎是一個(gè)理想的策略27。2.3.2 與人血清白蛋白或半結(jié)合清蛋白融合將scFvs與HSA或半結(jié)合清蛋白融合可以延長其的血清半衰期。此外，HSA與FcRn相互作用不會(huì)改變抗原結(jié)合的親和力。這種策略被抗體工程師廣泛采用。抗體與白蛋白融合/結(jié)合后不僅增加了其分子的大小，還能促進(jìn)bsAbs再利用，延長半衰期。白蛋白被細(xì)胞吸收后，會(huì)首先與早期內(nèi)涵體上的FcRn結(jié)合，從而避免被破壞。然后，

29、白蛋白被重新運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)膜并釋放到血漿27。梅里馬克公司（Merrimack）采用這個(gè)方法成功開發(fā)出MM-111。Ozoralizumab(ATN-103，Ablynx)是一種來自于駱駝的重鏈制成的分子量為38kDa的三價(jià)雙特異性納米抗體。理論上，這樣的小分子藥物容易被腎臟清除。為了解決這個(gè)問題，ozoralizumab被設(shè)計(jì)成與HAS結(jié)合，保留了其結(jié)合TNF-29的特異性。2.3.3 與Fc片段融合一些抗體工程師將Fc片段與基于單鏈抗體的bsAbs融合。Fc的片段不僅提高了分子的大小，還能通過FcRn促進(jìn)再利用。MacroGenics開發(fā)出Fc-bearing DART MGD007用于治療

30、結(jié)腸癌患者。2.3.4 多聚化多聚化是另一個(gè)通過調(diào)整大小和結(jié)合力來優(yōu)化bsAb半衰期的策略。 3 BsAbs的臨床應(yīng)用3.1 BsAbs重定向免疫效應(yīng)細(xì)胞以縮短其與腫瘤細(xì)胞的距離細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在對抗癌癥細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用30。然而，在免疫反應(yīng)過程中，腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)往往受限于被腫瘤細(xì)胞利用的免疫逃逸機(jī)制。免疫療法在過去幾年中的進(jìn)展已經(jīng)可以克服這一挑戰(zhàn)。一個(gè)利用免疫細(xì)胞的策略是利用bsAbs來殺死腫瘤細(xì)胞。幾個(gè)正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的bsAbs被設(shè)計(jì)成將T細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞31。這個(gè)過程伴隨著在T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間形成臨時(shí)的溶細(xì)胞突觸。隨后T細(xì)胞的激活和增殖導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被

31、裂解32。除了T細(xì)胞，其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞也被用于殺死腫瘤細(xì)胞。許多bsAbs包括Triomab、BiTR、DART及FynomAb為病人提供了新的治療手段。3.1.1 Triomab抗體將T細(xì)胞重定向至腫瘤采用小鼠/老鼠雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的Triomab抗體產(chǎn)量和純度都很高。目標(biāo)bsAbs與許多副產(chǎn)物混合在一起，比如單特異性抗體，以及輕鏈錯(cuò)配等，都將增加純化的難度。分別來自老鼠和小鼠的輕重鏈會(huì)優(yōu)先配對，可將輕重鏈錯(cuò)配比例下降至4%10 %33。這種bsAbs可以方便的使用Protein A純化5。Triomab抗體具有三重功，一條臂用于結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原；

32、第二臂用于結(jié)合T細(xì)胞上的CD3；Fc區(qū)域可以優(yōu)先識(shí)別輔助細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞和NK細(xì)胞）上的I(CD64)、II(CD32a)，III Fc(CD16)受體。隨后T細(xì)胞被激活，并釋放T細(xì)胞因子如TNF-和IFN-。此外，F(xiàn)cR陽性輔助細(xì)胞被重定向到腫瘤細(xì)胞并釋放的高水平的促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-12、GM-CSF及DC-CK134。通過T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞裂解、ADCC以及活化的輔助細(xì)胞的吞噬作用使腫瘤細(xì)胞裂解9(圖2)。圖2 Triomab®抗體將T細(xì)胞和其他輔助細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞Catumaxomab是首次被批準(zhǔn)用于癌癥治療的Triomab bsAb。它通過在一個(gè)宿主細(xì)胞

33、中共表達(dá)老鼠IgG2b和小鼠IgG2a生產(chǎn)出來。與BiTE相比，IgG樣 bsAb具有更長的血清半衰期。病人在913天內(nèi)接受4到5次腹腔注射給藥10 - 150g后8，大多數(shù)病人對Catumaxomab都表現(xiàn)出可接受的體液免疫反應(yīng)，這種抗藥反應(yīng)有利于臨床結(jié)果。這種保護(hù)依賴于catumaxomab嵌合Fc區(qū)域?qū)е碌拿庖咴苑磻?yīng)9。可能得不良反應(yīng)包括短暫發(fā)熱、惡心和嘔吐。大多數(shù)不良事件可能歸因于細(xì)胞因子釋放相關(guān)癥狀，并且是可逆的9。Catumaxomab被歐盟批準(zhǔn)用于治療標(biāo)準(zhǔn)療法無效的EpCAM陽性癌癥患者。Catumaxomab目前正在進(jìn)行卵巢癌、胃腸道癌癥、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腹膜癌的臨床實(shí)

34、驗(yàn)35。其他Triomab成員還有ertumaxomab和FBTA05。Ertumaxomab靶向HER2/neu，一個(gè)已被證實(shí)的乳腺腫瘤生物標(biāo)志物。通過將T細(xì)胞重定向至HER2/neu過表達(dá)的細(xì)胞，ertumaxomab可以殺死腫瘤細(xì)胞，即使細(xì)胞表面表達(dá)HER2/neu較低，也同樣有效36。在I期臨床研究中，15個(gè)接受ertumaxomab治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，有5個(gè)顯示了抗腫瘤反應(yīng)37。FBTA05特異性的結(jié)合B細(xì)胞上的CD20和T細(xì)胞上的CD3，該藥正在針對CD20陽性B細(xì)胞惡性腫瘤患者進(jìn)行I/II期臨床實(shí)驗(yàn)38。 3.1.2 BiTEs將T細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞BiTE平臺(tái)

35、用來開發(fā)串聯(lián)單鏈型bsAbs。Blinatumomab可同時(shí)與T細(xì)胞上的CD3和表達(dá)CD19的B細(xì)胞惡性腫瘤39。這是美國FDA批準(zhǔn)的第一bsAb，分子量55KDa，用于治療急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞40。此外，用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)正處于II、III期臨床實(shí)驗(yàn)階段，用于治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)正處于II期臨床實(shí)驗(yàn)階段，用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)正處于I期臨床實(shí)驗(yàn)階段。Blinatumomab能將T細(xì)胞運(yùn)輸至腫瘤細(xì)胞并顯示出強(qiáng)大的腫瘤殺傷能力(圖3)。大量匯集的各種蛋白酶原為在T細(xì)胞和靶細(xì)胞間形成形成溶細(xì)胞突觸提供了基礎(chǔ)的組分41。與此同時(shí)，T細(xì)胞開始增殖并釋放

36、細(xì)胞因子如TNF-、IFN-、IL-6、IL-2、IL-4和IL-1042。BiTE分子在極低濃度10-100pg/ml時(shí)都具有強(qiáng)大的重定向T細(xì)胞至CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞的能力。體內(nèi)劑量> 15g / m2/天時(shí)將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死光。Blinatumomab的血清半衰期小于2 h。病人通過一個(gè)注射接口系統(tǒng)注入BiTE并觀察3 - 7天。在II期臨床實(shí)驗(yàn)中，在高復(fù)發(fā)或難治性淋巴細(xì)胞白血病患者中獲得了43%的完全應(yīng)答率，中位生存期達(dá)6.1個(gè)月23。Blinatumomab也有一些缺點(diǎn)，因?yàn)橛行┎∪嘶加猩窠?jīng)毒性，因此而顯示出細(xì)胞因子釋放綜合癥的癥狀23。由于其體積小，blinatumomab可以

37、很容易地被腎臟清除，因此患者需要每48小時(shí)更換輸液袋32。應(yīng)該注意的是，一些患者接受blinatumomab后會(huì)產(chǎn)生耐藥性43，產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制包括但不限于，CD19虧損、骨髓復(fù)發(fā)、腫瘤細(xì)胞上調(diào)程序死亡受體143。圖3 BiTE®抗體重定向T細(xì)胞至腫瘤細(xì)胞除了blinatumomab之外，其他一些BiTE如solitomab(抗CD3和EpCAM，用于治療實(shí)體瘤，完成I期臨床研究)，MEDI-565(抗CD3和CEA，用于治療胃腸道腺癌，完成I期臨床研究)，BAY2010112(抗CD3和PSMA，用于治療前列腺癌，正在進(jìn)行I期臨床研究)也正在研究中44。3.1.3 DARTs將T細(xì)

38、胞重定向至腫瘤細(xì)胞DART技術(shù)采用小的連接肽，以增加bsAbs的穩(wěn)定性和降低免疫原性。和BiTE不同，DARTs兩條鏈間的共價(jià)連接限制了抗原結(jié)合位點(diǎn)的自由度。因此，DARTs的結(jié)構(gòu)緊湊，可以在目標(biāo)和感受細(xì)胞間形成穩(wěn)定的接觸。Moore等證明了CD19×CD3 DART在重定向并殺死B細(xì)胞淋巴瘤方面比BiTE分子更有效22。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是DART型式的抗體對CD3有更高的親和力以及對CD19的解離速率常數(shù)低45。然而，只有一個(gè)研究進(jìn)行并行對比，很難得出哪種型式比較好的結(jié)論。需要更多的臨床試驗(yàn)來評估DART和BiTE間哪種型式更具優(yōu)勢45。然而，MOORE等證實(shí)了，DART可以

39、作為一種T細(xì)胞激活劑的替代物。哺乳動(dòng)物和原核系統(tǒng)都可用于抗體的表達(dá)。到目前為止，已經(jīng)制成了超過70個(gè)DART產(chǎn)品5。DARTs的治療機(jī)制包括激活腫瘤殺傷效應(yīng)器細(xì)胞、靶向受體或細(xì)胞因子、與致病性抗原表位結(jié)合。兩個(gè)產(chǎn)品目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。MGD006通過重定向T細(xì)胞以殺死白血病細(xì)胞來治療急性髓系白血病(AML)46。它有兩個(gè)特異的靶臂：一個(gè)針對白血病干細(xì)胞上的CD123，另一個(gè)針對T細(xì)胞上的CD3。目前，MGD006用于治療AML正處于I期臨床研究階段。和MGD006不同，MGD007是含F(xiàn)c DARTs。顯然，融合Fc片段后避免被容易的清除并依靠FcRn依賴性再利用延長血清保留時(shí)間。MGD00

40、7重定向T細(xì)胞至gpA33陽性結(jié)腸癌并介導(dǎo)gaA33陽性細(xì)胞有效的裂解47。目前，MGD用于治療結(jié)直腸癌正處于I期臨床研究階段。3.1.4 TandAbs重定向免疫細(xì)胞殺死腫瘤TandAbs由四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)組成，但是沒有Fc片段。比BiTE分子量大，約114 kDa48。因此，他們比BiTE和diabodies的血清半衰期更長。TandAbs可以在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)。和BiTE的一個(gè)主要區(qū)別是，TandAbs對每種特異性均顯示出二價(jià)綁定活性一種提高靶點(diǎn)結(jié)合親和力的重要手段。他們在重定向免疫細(xì)胞至腫瘤細(xì)胞并促使細(xì)胞裂解方面相當(dāng)有效。AFM13是一個(gè)含有鼠抗CD30結(jié)構(gòu)域的四價(jià)bsAb。它能與

41、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的CD16A特異結(jié)合49。CD16A是一個(gè)參與殺死腫瘤細(xì)胞的活性受體。在霍奇金病人中，CD30在霍奇金和Reedsternberg細(xì)胞中高度表達(dá)。AFM13招募并激活NK細(xì)胞以誘導(dǎo)CD30陽性腫瘤細(xì)胞裂解。劑量限制性毒性如溶血性貧血可能可能在接受AFM13治療的病人中出現(xiàn)。此外，在一些病人中也觀察到抗藥反應(yīng)49。目前，AFM13用于霍奇金疾病治療正處于II期臨床研究階段。與AFM13不同，AFM11重定向T細(xì)胞至CD19陽性淋巴瘤。AFM11用于治療非霍奇金淋巴瘤和淋巴細(xì)胞白血病正處于I期臨床試驗(yàn)中。3.2 BsAbs阻斷信號(hào)通路作為細(xì)胞表面生長因子受體的一個(gè)亞類，酪氨酸激

42、酶受體(RTKs)極積的參與了腫瘤形成50。幾個(gè)單特異性RTK靶向抗體包括赫賽汀(用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、伊馬替尼(用于CML和GIST)、吉非替尼(用于NSCLC)和西妥昔單抗(用于結(jié)腸癌)已經(jīng)批準(zhǔn)用于癌癥治療50。然而，疾病的發(fā)生是由多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮單一的或重疊的功能引起的。因此，采用一個(gè)分子同時(shí)阻斷兩個(gè)靶點(diǎn)將比單克隆抗體更具療效。3.2.1 HAS融合bsAbsMM-111是一個(gè)將兩個(gè)scFvs融合至修飾后的HSA的bsAb51。它同時(shí)靶向HER3/HER2信號(hào)通路。HER2是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證大量癌癥的靶標(biāo)。HER3信號(hào)是HER2抑制劑耐藥性的重要機(jī)制。雙重針對HER2/HER3可能產(chǎn)生更有效的反

43、應(yīng)。MM-111單獨(dú)或與曲妥珠單抗聯(lián)合用于治療HER2陽性實(shí)體瘤正處于臨床試驗(yàn)中27。3.2.2 ScFv-IgGsMM-141是另一個(gè)靶向胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)和HER3的bsAb。與MM-111不同的是，MM-141是一個(gè)將兩個(gè)scFv融合到一個(gè)IgG固定區(qū)域的IgG樣bsAb。HER3和IGF-IR同時(shí)激活PI3K/AKT/mTOR軸一種靶向抵抗機(jī)制。MM-141與HER3和IGF-IR結(jié)合后，阻止了下游抗性機(jī)制52。MM-141用于肝癌治療目前正處于I期臨床研究階段。3.2.3 二合一抗體Duligotuzumab是一個(gè)源自噬菌體的二合一(DAF) 人源化抗體。它與HER

44、3和EGFR結(jié)合后，導(dǎo)致HER家族下游信號(hào)通路被抑制53。下調(diào)EGFR和HER3依賴性信號(hào)是人類癌癥如頭頸癌和結(jié)腸直腸癌的發(fā)病機(jī)制。接受EGFR抑制劑西妥昔單抗（cetuximab）治療的患者經(jīng)常發(fā)展出抗EGFR耐藥性。結(jié)合輻射治療時(shí)，duligotuzumab克服了耐藥性，并且能增強(qiáng)輻射治療的效果。目前，duligotuzumab用于治療上皮腫瘤和頸部鱗狀細(xì)胞癌正處于聯(lián)創(chuàng)研究中。在II期臨床實(shí)驗(yàn)中，對治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，Duligotuzumab表現(xiàn)與西妥昔單抗相似的抗腫瘤活性54。應(yīng)該注意的是，接受duligotuzumab治療的患者極易發(fā)生發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少、低鉀血、惡

45、心、和脫水等不良反應(yīng)55。3.3 靶向腫瘤血管生成的雙特異性抗體血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。多種血管生成因子包括血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)、VEGFR3、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA)、血管生長素、血小板源生長因子(PDGFSB)均參與腫瘤血管生成。許多癌癥療法采用耗盡這些蛋白以破壞血管生成56。雙重靶向血管生成因素會(huì)獲得更好的結(jié)果57。RG7221靶向兩個(gè)關(guān)鍵的血管生成因子：VEGFA和促血管新生蛋白因子-2(Ang-2)的人IgG1樣CrossMab。在臨床前模型中，與單一通路抑制劑相比，RG7221具有很強(qiáng)的抑制血管生成和腫瘤生長的作用14。目前，RG7221用于

46、治療大腸癌正處于II期臨床研究階段。I期臨床研究數(shù)據(jù)顯示，接受RG7221治療的患者可能出現(xiàn)高血壓、無力、頭痛和疲勞等不良反應(yīng)14。RG7716 是與RG7221相似的CrossMab，同樣也是用于阻止VEGFA和Ang2，該藥用于治療濕式年齡相關(guān)性黃斑變性(wet AMD)患者正處于II期臨床研究階段。3.4 BsAbs阻斷細(xì)胞因子一些細(xì)胞因子被確認(rèn)為催生炎癥和自身免疫性疾病的關(guān)鍵介質(zhì)58。因此，阻斷這些細(xì)胞因子具有治療潛力。例如，抑制TNF-對治療牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、少年關(guān)節(jié)炎，和許多其他疾病具有相當(dāng)好的療效59。其他已證實(shí)具有此類效果的細(xì)胞因子包括IL - 6、

47、IL-17、IL-1、IL-12、IL-4和IL-13 等。59 -623.4.1 納米抗體（Nanobodies）Ozoralizumab(ATN-103)是由Ablynx開發(fā)的對TNF-和HAS具有高親和力的三價(jià)小分子納米抗體。該抗體與白蛋白結(jié)合后能夠提高其血清半衰期63。Ozoralizumab用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)已經(jīng)完成II期臨床研究，結(jié)果顯示它明顯改善了RA患者的病情。Ozoralizumab以其獨(dú)特的分子特性如體積小、免疫原性低和血清半衰期長等，使人們對其應(yīng)用于臨床滿懷信心。Ablynx開發(fā)的相似的納米抗體包括靶向IL-6R/HSA用于治療RA的ALX-0061和靶向IL

48、-17A / F用于治療炎癥的ALX-076164,65。3.4.2 SAR156597SAR156597是能夠同時(shí)結(jié)合IL-13和IL-4的四價(jià)雙特異性串聯(lián)IgG。從結(jié)構(gòu)上看，SAR156597是一個(gè)IgG分子(抗IL4抗體)，其N末端融合了抗IL-13抗體可變區(qū)66。其應(yīng)用于特發(fā)性肺纖維化治療已經(jīng)完成I/II期臨床研究67。3.5 BsAbs作為運(yùn)載工具bsAbs一個(gè)有趣的應(yīng)用是做為運(yùn)輸工具傳遞如藥物、放射性同位素標(biāo)記、納米顆粒等。其裝載的藥物一旦釋放后，雙特異性分子能夠從血液中清除出去。雙特異性分子可以用來在腫瘤位點(diǎn)富集藥物26, 68-70。這種策略顯著延長了血清保留時(shí)間，提

49、高了腫瘤/血液比。3.5.1 DNL采用DNL方法制備的雙特異性TF2被用于腫瘤成像和放射免疫療法。它能特異性的與CEA和99mT標(biāo)記的組胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)半抗原結(jié)合。在臨床試驗(yàn)中，首先注射TF2，待該bsAb從血液中清楚后，再注射99mT標(biāo)記的HSG。腫瘤攝入的99mT越多，觀察到的腫瘤/血液比越高。目前，TF2用于大腸癌患者的治療正處于I期臨床研究階段71。TF2的其他臨床研究有：靶向177LuHSG/111InHSG和CEA用于治療直腸腫瘤患者的放射免疫療法和靶向68GaHSG和CEA的免疫正電子發(fā)射斷層掃描。4 BsAbs在臨床前開發(fā)4.1 BsAbs用于穿越血腦屏障BsAbs一個(gè)有前途的應(yīng)用是穿過血腦屏障(BBB)靶向引起神經(jīng)