體內藥物分析課件

1、f分析方法的設計依據分析方法的設計依據f分析方法建立的一般步驟分析方法建立的一般步驟f分析方法驗證的內容與要求分析方法驗證的內容與要求f體內藥物分析應用示例體內藥物分析應用示例本章內容提要本章內容提要第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié)第一節(jié) 分析方法的設計依據分析方法的設計依據建立分析檢測方法的主要依據建立分析檢測方法的主要依據 待測藥物的理化性質及在生物體內的存在狀況待測藥物的理化性質及在生物體內的存在狀況 分析測定的目的與要求分析測定的目的與要求 生物樣品的類型與預處理方法生物樣品的類型與預處理方法 實驗室條件實驗室條件第四章 分析方法的建立與驗證一、一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況待

2、測藥物的理化性質及體內存在狀況準確測定準確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物生物樣品中的藥物或其特定代謝物預處理預處理待測物待測物從結合物或綴合物中從結合物或綴合物中釋放釋放選擇樣品選擇樣品預處理方法預處理方法首先應考慮首先應考慮待測藥物的待測藥物的理化性質理化性質藥物在生物體內的藥物在生物體內的存在狀況存在狀況藥物在生物體內的藥物在生物體內的生物轉化生物轉化( (代謝代謝) )途徑途徑第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據(一一)待測藥物的理化性質待測藥物的理化性質藥物的藥物的pka值、親脂性、溶解度、分配系數等值、親脂性、溶解度、分配系數等預處理及檢測方法預處理及檢測方法具

3、有具有親脂性親脂性在適當的在適當的ph值下用值下用溶劑萃取溶劑萃取具有具有強極性或親水性強極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取衍生化后萃取等等具有具有揮發(fā)性揮發(fā)性gc測定法測定法具有具有光譜或電化學特性光譜或電化學特性分析檢測方法分析檢測方法藥物的藥物的穩(wěn)定性穩(wěn)定性萃取濃縮技術萃取濃縮技術對酸堿不穩(wěn)定對酸堿不穩(wěn)定避免使用強酸或強堿性溶劑避免使用強酸或強堿性溶劑對熱不穩(wěn)定對熱不穩(wěn)定避免高溫蒸發(fā)溶劑避免高溫蒸發(fā)溶劑第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據( (二二) )待測藥物的體內存在狀態(tài)待測藥物的體內存在狀態(tài)與血漿蛋白結合的強弱

4、及結合率的高低與血漿蛋白結合的強弱及結合率的高低分離萃取方法分離萃取方法蛋白結合較強蛋白結合較強不宜直接采用溶劑萃取不宜直接采用溶劑萃取體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物分析檢測技術分析檢測技術濃度較低濃度較低（尤其有（尤其有代謝產物代謝產物共存）共存）代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定采用采用lc-ms、eia等分析檢測技術等分析檢測技術 第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據二、分析測定的目的與要求二、分析測定的目的與要求體內藥物分析的目的體內藥物分析的目的影響影響分析方法分析方法的應用的應用藥代動

5、力學藥代動力學研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄過程研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄過程血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產物血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產物要求要求 同時測定原形藥物和代謝產物同時測定原形藥物和代謝產物檢測檢測 寬線性范圍寬線性范圍(cmaxcmax的的1/20)、高靈敏度高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬和高專屬 性性(分離能力分離能力)(原形藥物及其代謝產物的分離原形藥物及其代謝產物的分離)方法方法 不必強調方法的簡便、快速；不必強調方法的簡便、快速；大多采用色譜及其脫線或在線聯用技術，如大多采用色譜及其脫線或在線聯用技術，如hplc、lc-ms

6、第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據二、分析測定的目的與要求二、分析測定的目的與要求臨床治療藥物監(jiān)測臨床治療藥物監(jiān)測 有效治療濃度范圍內藥物濃度有效治療濃度范圍內藥物濃度方法方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定大多采用大多采用uv、ria或或eia等等中毒患者的臨床搶救中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高藥物濃度極高方法方法不必強調方法的靈敏度，強調方法的不必強調方法的靈敏度，強調方法的特異性特異性和和分析速度分析速度大多采用色譜及其聯用技術大多采用色譜及其聯用技術gc、gc-ms、ria或或eia第四章 分析方法的建立與驗證第

7、一節(jié) 分析方法的設計依據三、生物樣品的類型與預處理方法三、生物樣品的類型與預處理方法生物樣品的類型與預處理方法生物樣品的類型與預處理方法決定決定分析方法分析方法的應用的應用以血漿或血清為分析樣品以血漿或血清為分析樣品采用采用蛋白沉淀蛋白沉淀-溶劑萃取溶劑萃取預處理技術預處理技術分析樣品較為分析樣品較為“干凈干凈”，可用，可用hplc檢測檢測用用ria分析分析樣品的預處理方法可較為樣品的預處理方法可較為粗放粗放經過簡單的蛋白沉淀或不經任何預處理經過簡單的蛋白沉淀或不經任何預處理直接測定直接測定第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據四、實驗室條件四、實驗室條件在設計體內藥物分析方法

8、時，還應充分考慮在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到實驗室現有的或有可能在其它實驗室使用的儀到實驗室現有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。器裝備，合理選擇可行的分析方法。第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設計依據第二節(jié)第二節(jié) 分析方法分析方法建立的一般步驟建立的一般步驟 第四章 分析方法的建立與驗證一、分析方法的選擇一、分析方法的選擇體內藥物分析方法的設計體內藥物分析方法的設計生物樣品中的生物樣品中的藥物濃度藥物濃度決定分析方法的決定分析方法的首要因素首要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產物的生物樣品中藥物或其特定代謝產物的濃度低、樣品量少濃度低、樣品

9、量少難以通過難以通過增加取樣量增加取樣量提高方法靈敏度提高方法靈敏度通過通過選擇適當的分析方法選擇適當的分析方法適應樣品分析需求適應樣品分析需求體內藥物分析中常用分析方法體內藥物分析中常用分析方法特點見特點見表表4-14-1第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟二、分析方法的建立二、分析方法的建立 分析方法建立之前分析方法建立之前查閱文獻資料查閱文獻資料充分了解藥物在體內的充分了解藥物在體內的動力學過程，動力學過程，使所使所擬定的分析方法擬定的分析方法避免受到代謝產物的干擾適用于實際生物樣品測定避免受到代謝產物的干擾適用于實際生物樣品測定第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析

10、方法的建立步驟二、分析方法的建立二、分析方法的建立 初步擬定分析方法后初步擬定分析方法后進行一系列試驗工作進行一系列試驗工作選擇最佳分析條件選擇最佳分析條件同時同時驗證分析方法的可行性驗證分析方法的可行性確認是否適用于實際生物樣品確認是否適用于實際生物樣品f 分析方法的分析方法的建立建立和和驗證驗證過程過程是不可截然劃分的是不可截然劃分的 為便于討論而分別敘述為便于討論而分別敘述f 分析方法的建立步驟分析方法的建立步驟第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟( (一一) )檢測條件的篩選檢測條件的篩選標準物質標準物質 照擬定的分析方法(不包括生物基質的預處理)測定 確定最佳分析檢

11、測條件確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度檢測靈敏度hplc 調整檢測器檢測器(類型、條件) 色譜柱色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經、柱長度) 流動相流動相(組分及其配比)及其流速 柱溫柱溫、進樣量進樣量、內標物質內標物質的濃度及其加入量等 使各物質具有足夠的足夠的方法靈敏度方法靈敏度(loq) 良好的良好的色譜參數色譜參數(n、r、t) 適當的適當的保留時間保留時間(tr)第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟( (二二) )分離條件的篩選分離條件的篩選在進行分離條件篩選時，應考察生物基質中的內源性物質及代謝產物對分離與檢測的干擾，步驟如下：1空白溶劑試驗空白溶劑

12、試驗 溶劑(方法特異性方法特異性)2空白生物基質試驗空白生物基質試驗 endogenous compounds(方法特異性方法特異性)3模擬生物樣品試驗模擬生物樣品試驗 方法效能指標方法效能指標4實際生物樣品測試實際生物樣品測試 代謝產物(方法特異性方法特異性)第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟1空白溶劑試驗空白溶劑試驗待測藥物的非生物基質溶液非生物基質溶液（通常為水溶液）采用擬定的分析方法進行擬定的分析方法進行衍生化反應、萃取分離等 樣品預處理預處理（反應試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等）測定響應信號響應信號（如hplc峰面積或峰高）考察目標考察目標方法的特異性特異性空白值應

13、盡可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟色譜分析法色譜分析法可通過改變反應條件、萃取方法或萃取條件改變反應條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型檢測器類型空白試劑信號應不干擾藥物的測定不干擾藥物的測定（如r1.5） 本步驟主要考察本步驟主要考察需經化學反應需經化學反應的預處理過程的預處理過程，若預處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進行該步驟，直接進行空白生物基質試驗 第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟2. 空白生物基質試驗空白生物基質試驗空白生物基質空白生

14、物基質 (blank biological matrix)如空白血漿空白血漿照 “1. 空白溶劑試驗空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標考察目標生物基質中內源性物質內源性物質對測定的干擾對測定的干擾（方法特異性）在待測藥物(或特定的活性代謝物、內標物質等)的“信號窗信號窗”（信號附近的有限范圍）內不應出現內源性物質信號內源性物質信號第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟3. 模擬生物樣品試驗模擬生物樣品試驗模擬生物樣品模擬生物樣品( (質量控制質量控制, ,qc樣品樣品) )空白生物基質中加入待測藥物照 “1. 空白溶劑試驗空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標考察目標方法的線性

15、范圍線性范圍、精密度與準確度精密度與準確度、靈敏度靈敏度 藥物的萃取回收率萃取回收率等各項技術指標同時進一步進一步檢驗生物基質中內源性物質以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性方法特異性第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟色譜分析法色譜分析法進一步考察待測藥物(或內標物)與內源性物質(或其它藥物)的分離情況分離情況色譜峰的 tr、n 和 t 是否與水溶液的一致一致 色譜峰是否為單一成分單一成分 標準曲線的截距是否顯著偏離零點偏離零點等內源性物質內源性物質是否對待測藥物或內標物質是否對待測藥物或內標物質構成干擾構成干擾第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方

16、法的建立步驟4. 實際生物樣品的測試實際生物樣品的測試空白生物基質和模擬生物樣品試驗確定的分析方法及其條件不能完全確認是否適合于實際生物樣品的測定藥物在體內可能與內源性物質結合(如血漿蛋白結合物血漿蛋白結合物) 或代謝生成數個代謝產物代謝產物及其進一步的結合物結合物(或綴合物)實際生物樣品實際生物樣品確立分析方法后，確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試尚需進行實際生物樣品的測試考察目標考察目標代謝產物代謝產物對藥物、內標物質的干擾干擾情況進一步驗證方法的可行性驗證方法的可行性第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟第三節(jié)第三節(jié) 分析方法分析方法驗證的內容與要求驗證的內容與要

17、求用于實際生物樣品分析之前驗證驗證 (validation) 分析方法的可行性可行性與與可靠性可靠性方法驗證時應考慮影響分析方法所有可變因素(采樣,樣品制備,色譜分離,檢測與數據評價等)使用的技術指標技術指標效能指標效能指標使用的樣品樣品通常采用模擬生物樣品模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品實際生物樣品第四章 分析方法的建立與驗證驗證步驟驗證步驟首先為分析方法分析方法的驗證 特異性、精密度與準確度、回收率特異性、精密度與準確度、回收率定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性其次為生物基質中生物基質中待測藥物穩(wěn)定性穩(wěn)定性的驗證 室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍

18、-融循環(huán)融循環(huán)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求驗證的效能指標與基本要求驗證的效能指標與基本要求1特異性特異性避免干擾避免干擾2標準曲線與線性范圍標準曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍覆蓋所有濃度范圍3準確度準確度與實際狀況相符與實際狀況相符4精密度精密度結果可重現結果可重現5定量限定量限達到峰濃度的達到峰濃度的1/101/206穩(wěn)定性穩(wěn)定性確保所有樣品準確測定確保所有樣品準確測定7提取回收率提取回收率確保準確度確保準確度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求一、方法特異性一、方法特異性( (專屬性或選擇性專屬性或選擇性) )方法的特異性方法的特異性(spe

19、cificity)又稱專屬性或專一性，通常與選擇性(selectivity)互用系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力專屬性表示所檢測的信號信號(響應)系屬于待測藥物所特有待測藥物所特有的選擇性系指將待測物質與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)區(qū)分分( (分離分離) )的能力的能力特異性特異性函蓋二者，以驗證驗證所測定的物質與待測藥物的同一性同一性考察一個分析方法是否具有特異性，應著重考慮以下幾點：第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求1. 1. 內源性物質的干擾內源性物質的干擾比較比較待測藥物或其活性代謝產物待測

20、藥物或其活性代謝產物檢測信號檢測信號對照品（或標準品）空白生物基質模擬生物樣品（空白生物基質中添加對照品）如hplc色譜峰的 tr、n 和 t 是否一致 及與內源性物質色譜峰的 r確證確證內源性物質對分析方法有無內源性物質對分析方法有無干擾干擾第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2. 2. 代謝產物的干擾代謝產物的干擾比較比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號檢測信號與代謝產物(在實際樣品中 tr 隨隨時間延長而增加)的 r如hplc色譜峰的 tr、n 和 t 或改變色譜條件(色譜柱)再比較確證確證其它代謝產物對分析方法有無其它

21、代謝產物對分析方法有無干擾干擾結構已知的特定活性代謝物的測定結構已知的特定活性代謝物的測定必要時通過hplc-dad和lc-ms確證色譜峰的單純性和同一性對于結構未知的代謝產物的測定對于結構未知的代謝產物的測定可采用lc-lc-nmr進行結構的初步推測后，考察其干擾情況第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求3. 3. 伍用藥物的干擾伍用藥物的干擾tdm 時時還要考慮患者可能同時服用藥物還要考慮患者可能同時服用藥物( (通常為數有限通常為數有限) )的干擾的干擾 比較比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號檢測信號如hplc色譜峰的 tr、n 和 t 是否一致確證

22、確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況干擾情況第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求4. 4. 與參比方法的相關性與參比方法的相關性除上述方法外，有時還可使用除上述方法外，有時還可使用參比方法對照參比方法對照參比方法參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關系良好的色譜法如在tdm中使用uv(或ria)時, 可以hplc(或gc)為參比參比方法測定結果為橫坐標參比方法測定結果為橫坐標(x); 擬定方法結果為縱坐標擬定方法結果為縱坐標(y)用最小二乘法計算回歸方程 yabx (坐標標度相等)相關系數相關系數(r)表示兩種方法測得結果的一致性若若 r 1，表示擬定方法為非線性表示擬

23、定方法為非線性，如 ria 中抗血清滴度選擇不當第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求4. 4. 與參比方法的相關性與參比方法的相關性yabx截距截距(a) 表示擬定方法受到恒定干擾恒定干擾的程度內源性物質(uv)斜率斜率(b) 表示擬定方法受到比例干擾比例干擾的程度標記抗原不純(ria)與參比方法的相關性比較與參比方法的相關性比較除顯示分析方法的特異性外斜率斜率b表示兩種方法測得結果的一致性表示兩種方法測得結果的一致性若參比方法準確度良好若參比方法準確度良好若截距若截距a0, 則擬定方法的則擬定方法的準確度準確度(回收率回收率)為為100b(%)第四章 分析方法的建立與驗證

24、第三節(jié) 分析方法的驗證與要求二、標準曲線與線性范圍二、標準曲線與線性范圍標準曲線標準曲線（standard curve） calibration curve or working curve生物樣品中所測定藥物濃度與響應的生物樣品中所測定藥物濃度與響應的相關性相關性（比例的程度）（比例的程度）通常用回歸分析方法所得的通常用回歸分析方法所得的回歸方程回歸方程來評價來評價除少數方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為除少數方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式線性模式回歸分析法為回歸分析法為最小二乘法最小二乘法（least squares）或或加權最小二乘法加權最小二乘法（weighted le

25、ast squares）線性范圍線性范圍（linear rang）標準曲線的標準曲線的最高最高與與最低最低濃度的區(qū)間濃度的區(qū)間模擬生物樣品的測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度模擬生物樣品的測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求二、標準曲線與線性范圍二、標準曲線與線性范圍( (續(xù)續(xù)) )標準曲線標準曲線用用模擬生物樣品模擬生物樣品建立建立線性范圍線性范圍(不包括不包括零點零點)應能應能覆蓋全部生物樣品覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度中的藥物濃度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標

26、準曲線所使用的模擬生物樣品建立標準曲線所使用的模擬生物樣品應使用與待測的含藥生物樣品應使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質相同的生物基質制備制備第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求標準曲線的一般建立方法標準曲線的一般建立方法 1. 標準系列溶液標準系列溶液(非生物基質溶液非生物基質溶液)的的制備制備溶劑溶劑水或甲醇水或甲醇（或其他適當溶劑）（或其他適當溶劑）濃度濃度標準模擬生物樣品中藥物濃度的標準模擬生物樣品中藥物濃度的 50倍以上倍以上 加入量為生物樣品總體積的加入量為生物樣品總體積的 2%以下以下 避免標準模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異避免標準模擬生物樣品與實際樣

27、品存在較大差異濃度較低濃度較低應應除去溶劑除去溶劑后再加入生物基質后再加入生物基質 否則否則,在實際樣品測定時應在實際樣品測定時應加入等體積的溶劑加入等體積的溶劑并渦旋混勻并渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2. 2. 標準系列溶液的濃度范圍標準系列溶液的濃度范圍至少含至少含58個濃度點個濃度點(不包括零點不包括零點,即空白即空白)可可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式等比梯度模式比例常數約為比例常數約為 2)若體內平均達峰濃度為若體內平均達峰濃度為50，其，其1/20為為2

28、.5設定最高濃度為設定最高濃度為100，最低濃度為，最低濃度為1 (個體差異個體差異)實際制備時：實際制備時：500、250、100、50、20、10 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求3. 3. 標準系列模擬生物樣品的制備標準系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質空白生物基質(如血漿如血漿)加入標準系列溶液適量，渦旋混勻加入標準系列溶液適量，渦旋混勻為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失先加入標準溶液先加入標準溶液 再加入空白生物基質再加入空白生物基質 渦旋混勻渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求

29、4. 4. 標準曲線的繪制標準曲線的繪制以待測藥物的檢測響應以待測藥物的檢測響應(如色譜峰面積或峰高如色譜峰面積或峰高) 或與內標物質的檢或與內標物質的檢測響應的比值測響應的比值(內標法內標法)(因變量因變量, y )對模擬血藥濃度對模擬血藥濃度 (自變量自變量,x)求得回歸方程求得回歸方程( yabx )及其相關系數及其相關系數( )在一組由至少在一組由至少7個濃度個濃度(不包括零點不包括零點)構成的標準曲線中，構成的標準曲線中，至多可至多可有有2個濃度點數據，可予剔除。個濃度點數據，可予剔除。但應有確切原因，如：但應有確切原因，如：樣品處理有損失、色譜圖有問題，或樣品處理有損失、色譜圖有問

30、題，或顯著偏離標準曲線該數據參與標準曲線回歸后，計算顯著偏離標準曲線該數據參與標準曲線回歸后，計算qc樣品或返算該點濃度時顯著偏離其標稱濃度樣品或返算該點濃度時顯著偏離其標稱濃度(配制濃度配制濃度)其余其余應有至少應有至少5個濃度點在標準曲線上個濃度點在標準曲線上第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求5. 5. 加權最小二乘法加權最小二乘法最小二乘法最小二乘法每個濃度點每個濃度點絕對誤差絕對誤差(yiyi)賦予同等的重要性賦予同等的重要性 標準曲線上的高低濃度相差懸殊標準曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達范圍達102)低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求低濃度區(qū)的計算

31、值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求加權最小二乘法加權最小二乘法回歸計算時增加一個回歸計算時增加一個權重因子權重因子(w)各濃度的響應值與回歸值的相對離差平方和達到最小各濃度的響應值與回歸值的相對離差平方和達到最小式中，式中，wi為標準曲線上第為標準曲線上第i個濃度點的權重因子個濃度點的權重因子2iiiyyy2) (iiiyyw2) (iiyy第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求1）回歸方程）回歸方程(y = a + b x)參數的計算參數的計算22biiiiiiiiiiiiixwxwwywxwyxww222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxwiiiiiw

32、xwywba 或，22/riiiiiiiiiiwywywwywbxaw第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2）權重因子的選擇）權重因子的選擇加權加權賦予低濃度點以更大的權重賦予低濃度點以更大的權重在實際工作中的一般方法在實際工作中的一般方法當當wi=1/(yi)2時，則時，則而而yi與與xi成正比成正比所以，令所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取通常取wi=1/c2)當當高濃度點高濃度點測量值的準確度測量值的準確度下降過大下降過大低濃度點權重過大，低濃度點權重過大，降低降低低濃度點的低濃度點的權重權重，wi=k/xi2) (iiiyyw2iiiyyy第四章

33、分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求標準曲線的標準曲線的限度要求限度要求藥代動力學或生物利用度研究藥代動力學或生物利用度研究標準曲線至少包括標準曲線至少包括5個濃度個濃度(通常為通常為58個濃度個濃度,不包括零點不包括零點)最高濃度應高于達峰濃度最高濃度應高于達峰濃度(cmax)；最低濃度應低于；最低濃度應低于cmax的的10%5%，并應為方法的，并應為方法的loq(非非lod)回歸方程的截距應接近于零回歸方程的截距應接近于零相關系數要求相關系數要求 0.99(色譜法色譜法)或或0.98(生物學方法生物學方法)若非線性，可分為高低若非線性，可分為高低兩個濃度區(qū)間兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)

34、間不少于每個區(qū)間不少于5個濃個濃度度)，分別加權回歸，分別加權回歸如如1、2、5、10、20和和10、20、50、100、200第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求三、準確度三、準確度方法準確度方法準確度(accuracy)系指用該方法系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度度的接近程度應使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的應使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定所以，通常使用模擬生物樣品測定一般用一般用相對回收率相對回收率(relative recove

35、ry，rr) 或或 相對誤差相對誤差(relative error，re)表示表示第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求1. 1. 測定法測定法取空白生物基質（如血漿）數份，照標準曲線項下方法操作，取空白生物基質（如血漿）數份，照標準曲線項下方法操作，用標準曲線計算用標準曲線計算在標準曲線范圍內制備質控在標準曲線范圍內制備質控(quality control，qc)樣品樣品高高(接近上限接近上限)、中、低、中、低(接近接近loq) 3個濃度個濃度每一濃度至少每一濃度至少5個樣本個樣本與隨行的標準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定與隨行的標準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測

36、定1次次 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2. 2. 結果計算與限度要求結果計算與限度要求計算計算測定值測定值m (measured)平均值與理論濃度平均值與理論濃度(加入值加入值)a(added)比值比值相對回收率相對回收率相對誤差相對誤差限度要求限度要求相對回收率應在相對回收率應在85%115% (loq附近附近80%120%)re在在15% (loq附近為附近為20%)）（%100amrr）（）（%100%100rraamre第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision )系指每次測定結果與多

37、次測定的平均值的系指每次測定結果與多次測定的平均值的偏離程度偏離程度表示該分析方法的表示該分析方法的可重復性可重復性(reproducibility)反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法驗證的基本要點之一性，是方法驗證的基本要點之一實際生物樣品的量有限實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為如血漿，一般為0.52ml)使用模擬生物樣品測定使用模擬生物樣品測定 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求1. 1. 表示方法表示方法方法精密度一般用標準偏差方法精密度一般用標準偏差(standard deviation，sd)或或相對標準相對標準偏差偏差(relative s

38、tandard deviation，rsd)表示表示 sd=rsd= =包括批內包括批內(within-run或或intra-assay)rsd日內日內(within-day) 和批間和批間(between-run或或inter-assay)rsd日間日間(between-day，day-to-day)112nxxniii）（%100xsd）（%100112xnxxniii第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2. 2. 測定法測定法分別測定法分別測定法()照準確度項下方法，取空白生物基質照準確度項下方法，取空白生物基質(如血漿如血漿)數份，分別在同一數份，分別在同一批內和不

39、同批間制備高、中、低批內和不同批間制備高、中、低 3個濃度的個濃度的qc樣品，并分析測定樣品，并分析測定批內批內rsd每一濃度每一濃度56個樣品，每個樣品測定個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標準曲線次，用隨行標準曲線分別計算分別計算3個濃度及每個濃度及每1濃度的濃度的rsd批間批間rsd每每1分析批內每一濃度制備分析批內每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定個樣品，每個樣品測定1次；用次；用隨行標準曲線計算隨行標準曲線計算3個濃度個濃度(每一濃度每一濃度56個分析批數據個分析批數據)的的rsd第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2. 2. 測定法測定法連續(xù)測定法連續(xù)測定法()(

40、)若實際樣品測定所用的分析批次少于若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行批，也可進行3個批次的個批次的連續(xù)分析連續(xù)分析(每每1濃度的每濃度的每1批次為批次為56個樣本個樣本)方差分析法方差分析法 批間批間rsd =批內批內rsd = =(%)1001)(%)100112 xixxnxissiiia）（%100(%)100 xinssssxinssatote）（）（%100)(11212 xinxxnxxiiiiinjij第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求3. 3. 限度要求限度要求在藥代動力學和生物利用度研究中在藥代動力學和生物利用度研究中對對 g/ml級水平的級

41、水平的rsd一般應一般應10%ng/ml級水平的級水平的rsd一般應一般應15%在在loq附近附近rsd應應20%。 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求五、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，loq)系指在保證具有一定可靠性系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求準確度與精密度符合要求)的前的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度又稱為方法靈敏度又稱為方法靈敏度(sensitivity)標準曲線上的最低濃度點標準曲線上的最低濃度點(最低濃度點最低濃度點loq)要求要求 應能滿足測

42、定應能滿足測定35個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度準確度在準確度在80%120%(或或re在在20%的范圍內的范圍內)rsd20%第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求六、穩(wěn)定性與質量控制六、穩(wěn)定性與質量控制穩(wěn)定性穩(wěn)定性包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性方法穩(wěn)定性方法穩(wěn)定性方法的耐用性方法的耐用性樣品穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性生物樣品的存放條件和時間、凍生物樣品的存放條件和時間、凍-融循環(huán)融循環(huán)測定法測定法qc樣品穿插于實際樣品測定全過程樣品穿插于實際樣品測定全過程模擬模擬(或實際或實際)生物樣品及其預處理后的待測溶液進行考察生物樣

43、品及其預處理后的待測溶液進行考察要求要求 準確度準確度85%115%(re在在15%范圍內范圍內)，rsd15%第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求七、萃取回收率七、萃取回收率生物樣品的預處理方法生物樣品的預處理方法重點考慮重點考慮方法準確度方法準確度(或或相對回收率相對回收率)，操作簡便、快速，操作簡便、快速萃取回收率萃取回收率(絕對回收率，絕對回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率與相對回收率的意義不同萃取回收率與相對回收率的意義不同萃取回收率萃取回收率考察生物樣品預處理過程造成的藥物的程度損失考察生物樣品預處理過程造成的藥物的程度損失相對回收率

44、相對回收率采用標準曲線可準確計算生物樣品中藥物濃度采用標準曲線可準確計算生物樣品中藥物濃度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求1 1. . 測定法測定法取空白生物基質取空白生物基質(如血漿如血漿)，照準確度項下方法，制備高、中、低，照準確度項下方法，制備高、中、低3個濃度的個濃度的qc樣品樣品(每一濃度至少每一濃度至少5個樣品個樣品)，每個樣品分析測定，每個樣品分析測定1次次另取等量的相同另取等量的相同3個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經提個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定at經萃

45、取后的經萃取后的qc樣品的檢測信號或比值樣品的檢測信號或比值(內標法內標法)as未經萃取的標準溶液的檢測信號或比值未經萃取的標準溶液的檢測信號或比值(內標法內標法)）（%100staar第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求2 2. . 限度要求限度要求萃取回收率一般應萃取回收率一般應50%高、中濃度的高、中濃度的rsd應應15%低濃度的低濃度的rsd應應20%。 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求第四節(jié)第四節(jié) 體內藥物分析方法體內藥物分析方法應用示例應用示例第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性鹽酸環(huán)丙沙星片人體生

46、物等效性研究研究一、文獻調研一、文獻調研性質性質在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。 第四章 分析方法的建立與驗證nofnnooh, hcl, h2o藥動學參數藥動學參數吸收過程吸收過程空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%70% cmax 口服口服500mg后平均后平均cmax為為

47、2.42.6mg/ltmax 12h t1/2 血中血中t1/2約為約為4h，腎功能減退時稍有延長至，腎功能減退時稍有延長至6h蛋白結合率蛋白結合率20%40%代謝代謝 口服給藥口服給藥24h內，內，40%50%原形、原形、15%代謝物經腎排出代謝物經腎排出第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求體內分析方法體內分析方法rp-hplc色譜柱色譜柱ods色譜柱色譜柱流動相流動相甲醇甲醇(乙腈乙腈)-磷酸磷酸(枸櫞酸枸櫞酸)緩沖液緩沖液(三乙胺調節(jié)三乙胺調節(jié)ph2.33.5)，或，或離子對色譜離子對色譜: 溴化十六烷基三甲基銨溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨氫氧化四丁基銨)檢測

48、檢測紫外或熒光檢測紫外或熒光檢測生物樣品預處理生物樣品預處理蛋白沉淀法蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣溶劑萃取法溶劑萃取法二氯甲烷二氯甲烷-異丙醇、氯仿異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑異丙醇混合溶劑蛋白沉淀蛋白沉淀-溶劑萃取溶劑萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取異丙醇提取 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求二、分析方法設計二、分析方法設計1分析方法分析方法血漿蛋白結合率低血漿蛋白結合率低(20%40%)、以原形從腎排泄、以原形從腎排泄生物等效性研究生物等效性研究測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度測定血漿

49、中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時間時間曲線。曲線。初步擬定初步擬定：采用：采用rp-hplc法法2檢測方法檢測方法紫外紫外靈敏度靈敏度1ng，若取血漿，若取血漿0.5ml，采用，采用3倍量乙腈沉淀蛋倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液白，取上清液100 l進樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在進樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，以上，當當cmax在在2 g/ml以上以上(口服口服500mg)時時基本可滿足基本可滿足生物等效性研究要求生物等效性研究要求熒光熒光靈敏度靈敏度0.1ng，能，能滿足滿足本試驗要求本試驗要求 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求二、分析方法設計（續(xù)）二、

50、分析方法設計（續(xù)）3樣品制備方法樣品制備方法初步擬定初步擬定采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進樣分析樣分析預試預試含含75%乙腈的提取液乙腈的提取液100 l進樣后，色譜峰理論板數、進樣后，色譜峰理論板數、對稱性下降對稱性下降(前沿峰前沿峰)，進而導致檢測靈敏度降低，進而導致檢測靈敏度降低(峰高降低峰高降低)經進一步試驗，經進一步試驗，確定為：確定為：血漿血漿0.5ml乙腈乙腈1ml沉淀蛋白沉淀蛋白二氯甲烷二氯甲烷-異丙醇異丙醇(95:5)5ml萃取萃取 60氮氣流吹干氮氣流吹干流動相流動相200 l溶解溶解20 l進樣進樣靈敏度可達靈敏度

51、可達2ng/ml(血漿濃度血漿濃度)，符合要求，符合要求(cmax2 g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求三、實驗方案三、實驗方案1給藥方案給藥方案20名受試者隨機分為兩組，每組名受試者隨機分為兩組，每組10人人第第1次試驗次試驗第一組口服受試制劑第一組口服受試制劑(相當于環(huán)丙沙星相當于環(huán)丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑，第二組口服相同劑量的參比制劑第第2次試驗次試驗第第1次服藥后第次服藥后第7天開始，兩組交換給藥天開始，兩組交換給藥第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求三、實驗方案（續(xù)）三、實驗方案（續(xù)）2血樣的采集與處理血樣

52、的采集與處理分別口服給藥前和給藥后分別口服給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和和24.0(57個個t1/2)小時小時由肘正中靜脈取血由肘正中靜脈取血 4 ml立即移入經肝素處理的離心試管中，靜置立即移入經肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心分鐘后，離心15分鐘分鐘(3000rpm)，分離血漿，分離血漿-20冰箱中保存待測冰箱中保存待測第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求三、實驗方案（續(xù)）三、實驗方案（續(xù)）3血樣分析法血樣分析法色譜條件色譜條件高效液相色譜儀高效液相色譜儀(包括包括lc-10atvp

53、泵，泵，rf-530熒光檢測器熒光檢測器)；色譜柱為色譜柱為kromasil ods-ap(200mm4.6 mm，5 m)流動相為乙腈流動相為乙腈-0.025mol/l磷酸溶液磷酸溶液(86:14)，流速，流速1.0ml/min檢測波長為檢測波長為 ex=277nm， em=445nm柱溫為柱溫為40。 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求三、實驗方案（續(xù)）三、實驗方案（續(xù)）3血樣分析法血樣分析法血漿樣品的預處理血漿樣品的預處理取血漿取血漿0.5ml，加內標溶液，加內標溶液(10 g/ml諾氟沙星甲醇溶液）諾氟沙星甲醇溶液）50 l、乙、乙腈腈1.0ml，渦旋混合，渦旋混

54、合30s，離心，離心5min，取上清液，取上清液1ml，加二氯甲烷，加二氯甲烷-異丙異丙醇醇(95:5)混合溶劑混合溶劑5ml，渦旋振蕩，渦旋振蕩1min，離心，離心5min，棄去上層水相，吸，棄去上層水相，吸取下層有機相，取下層有機相，60下氮氣流吹干，殘渣加流動相下氮氣流吹干，殘渣加流動相200 l，渦旋溶解，渦旋溶解30s，離心，離心5min，取上清液，取上清液20 l進樣進樣 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求四、分析方法驗證四、分析方法驗證1方法特異性方法特異性環(huán)丙沙星峰環(huán)丙沙星峰tr=12.4min，諾氟沙星，諾氟沙星(內標物質內標物質)tr=10.9min，各峰均，各峰均獲得完全分離，內源性物質峰獲得完全分離，內源性物質峰(與空白血漿樣品一致與空白血漿樣品一致)tr=8.6min對測定對測定無干擾無干擾志愿者用志愿者用藥后的血漿樣品藥后的血漿樣品色譜圖中環(huán)丙沙星與內標物質峰與色譜圖中環(huán)丙沙星與內標物質峰與模擬模擬血漿樣品血漿樣品中環(huán)丙沙星與內標物質峰的中環(huán)丙沙星與內標物質峰的tr、t、n和和r均一致，均一致，峰形相同峰形相同。故不認為代謝物有干擾故不認為代謝物有干擾第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求四、分析方法驗證四、分析方法驗證( (續(xù)續(xù)) )2標準曲線標準曲線標準系列溶液標準系列