第十五章核酸與核酸的研究方法

1、第十五章 核 酸核酸是遺傳物質(zhì)1868年瑞士Miesher.從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出可溶于堿而不溶于稀酸的酸性物質(zhì)。間接證據(jù)：同一種生物的不同種類的不同生長期的細(xì)胞，DNA含量基本恒定。直接證據(jù)：T2噬菌體DNA感染E.coli用35S標(biāo)記噬菌體蛋白質(zhì)，感染E.coli，又用32P標(biāo)記噬菌體核酸，感染E.coliDNA、RNA的分布（DNA在核內(nèi)，RNA在核外）。第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成核酸是一種線形多聚核苷酸，基本組成單位是核苷酸。結(jié)構(gòu)層次： 核 酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基組成核酸的戊糖有兩種：D-核糖和D-2-脫氧核糖，據(jù)此，可以將核酸分為兩種：核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DN

2、A） P330 表5-1 兩類核酸的基本化學(xué)組成一、 堿基1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 鳥嘌呤2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶P331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C。稀有堿基：100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物。DNA由A、G、C、T堿基構(gòu)成。RNA由A、G、C、U堿基構(gòu)成。二、 核苷核苷由戊糖和堿基縮合而成，糖環(huán)上C1與嘧啶堿的N1或與嘌呤堿的N9連接。核酸中的核苷均為-型核苷 P332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷DNA 的戊糖是：脫氧核糖RNA 的戊糖是：核糖三、 核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯化，生成核苷酸。

3、1、 構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸P333表5-32、 細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。環(huán)核苷酸cAMP（3，5-cAMP） cGMP（3，5-cGMP）它們作為質(zhì)膜的激素的第二信使起作用，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)一級：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級：DNA的兩條多聚核

4、苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。一、 DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通過3/、5/-磷酸二酯鍵連接起來的線形多聚體。3/、5/-磷酸二酯鍵是DNA、RNA的主鏈結(jié)構(gòu) 。 P334 圖 5-1書寫方法：5/ 3/：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3（在DNA中，3/-OH一般是游離的）在DNA分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表DNA生物學(xué)意義的是堿基的排列順序。遺傳信息貯存在DNA的堿基排列順序中，生物界生物的多樣性即寓于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化的精確的排列順序中。

5、二、 DNA的二級結(jié)構(gòu)1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff 規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射數(shù)據(jù)提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1、 Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)建立的根據(jù)Chargaff 規(guī)律 1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P334表54。b. DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物的DNA皆有自己獨(dú)特的堿基組成。c. DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。d. 年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。 DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。相對濕度92%，DNA鈉鹽結(jié)晶，BDNA。相對濕度75%，DNA鈉鹽結(jié)

6、晶，ADNA。 ZDNA。生物體內(nèi)DNA均為BDNA。Franklin 的工作2、 Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型P335 圖52a.兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53，另一條35b.嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過3/、5/-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架。 寬1.2 nm 寬0.6nm 大溝 小溝 深0.85nm 深0.75nmc.螺旋平均直徑2nm 每圈螺旋含10個(gè)核苷酸堿基堆積距離：0.34nm螺距：3.4nmd.兩條核苷酸鏈，依靠彼此堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。堿基平面垂直于螺旋軸。A=T、G

7、=C P336 圖54堿基互補(bǔ)原則具有極重要的生物學(xué)意義，DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)都是堿基互補(bǔ)。3、 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。三、 DNA二級結(jié)構(gòu)的不均一性和多型性（一） DNA二級結(jié)構(gòu)的不均一性1、 反向重復(fù)序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心區(qū)域?yàn)閷ΨQ軸，其兩側(cè)的堿基對順序正讀和反讀都相同，即對稱軸一側(cè)的片段旋轉(zhuǎn)180°

8、;后，與另一側(cè)片段對稱重復(fù)。較長的回文結(jié)構(gòu)，在某些因素作用下，可形成莖環(huán)式的十字結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。功能還不完全清楚，但轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。2、 富含A T的序列高等生物中，A+T與C+G的含量差不多相等，但在它們的染色體的某一區(qū)域，A T含量可能很高。在很多有重要調(diào)節(jié)功能（不是蛋白質(zhì)編碼區(qū)）的DNA區(qū)段都富含A T堿基對。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)的Pribnow框的DNA區(qū)中，富含A T對。這對于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始十分重要，因?yàn)镚 C對有三個(gè)氫鍵，而A T對只有兩個(gè)氫鍵，此處雙鍵易解開。（二） DNA二級結(jié)構(gòu)的多型性P339

9、 表5-6 A-、B-、Z-DNA的比較1、 BDNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個(gè)堿基對每對螺旋扭角36°螺距：3.32nm堿基傾角：1°2、 A-DNA在相對濕度75%以下所獲得的DNA纖維。A-DNA也是右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。3、 Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z0-DNA。4、 DNA三股螺旋在多聚嘧啶和多聚嘌呤組成的DNA螺旋區(qū)段，序列中有較長的鏡像重復(fù)時(shí)，可形成局部三股螺旋，稱H-DNA。鏡像重復(fù)：TAT配對C+GC酸對DNA的三鏈結(jié)構(gòu)常

10、出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始或調(diào)節(jié)位點(diǎn)，第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。四、 環(huán)狀DNA生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA某些噬菌體DNA某些細(xì)菌染色體DNA細(xì)菌質(zhì)粒DNA真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA1、 環(huán)形DNA的不同構(gòu)象P340 圖5-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋（1）、 松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、 解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、 正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA線形DNA擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。繩子的兩股以右旋方向纏繞，如果在一端使繩子向纏緊的

11、方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。對于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)小于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)，是正超螺旋。如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)大于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，是負(fù)超螺旋。2、 環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性以260bp組成的線形B-DNA為例，螺旋周數(shù)260/10.4=25。P340 圖25-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋連環(huán)數(shù)（L）DNA雙螺旋中，一條鏈以

12、右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。松馳環(huán)：L=25解鏈環(huán)：L=23超螺旋：L=23纏繞數(shù)（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示松馳環(huán)T=25解鏈環(huán)T=23超螺旋T=25超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù)W）松馳環(huán)W=0解鏈環(huán)W=0超螺旋W= -2L=T+W比連環(huán)差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L0L0是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般為-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9個(gè)負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起，很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等需要將兩條鏈分開才能進(jìn)行的反應(yīng)。3、 拓?fù)洚悩?gòu)酶此酶能改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的

13、L值。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（擰緊）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時(shí)，使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時(shí)能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA。五、 染色體的結(jié)構(gòu)1、 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體是由4.2×106bp組成的雙鏈環(huán)狀DNA分子，約3000個(gè)基因。大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白： 每個(gè)細(xì)胞H 兩個(gè)28KD的相同亞基 30000個(gè)二聚體HU 兩個(gè)各9KD的不同亞基 40000個(gè)二體聚體HLP1 17KD的亞基 20000個(gè)單體P 3KD的亞基 未知這些DNA結(jié)合蛋白，

14、使4.2×106bp的E.coli染色體DNA壓縮成為一個(gè)手腳架形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中心是多種DNA結(jié)合蛋白，DNA雙螺旋分子有許多位點(diǎn)與這些蛋白結(jié)合，形成約100個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的DNA都是負(fù)超螺旋，一個(gè)小區(qū)的DNA有兩個(gè)端點(diǎn)被蛋白質(zhì)固定，每個(gè)小區(qū)相對獨(dú)立。 圖用極微量的DNA酶I處理時(shí)，只能使少量小區(qū)的DNA成為松馳狀態(tài)，而其它小區(qū)仍然保持超螺旋狀態(tài)。2、 真核生物染色體主要由組蛋白和DNA組成。組蛋白是富含堿性a.a(Lys、Arg)的堿性蛋白質(zhì)，根據(jù)Lys/Arg比值不同，可分為H1、H2A、H2B、H3、H4五種，均為單鏈蛋白質(zhì)，分子量11000-21000。H2A、H2B、H3、

15、H4各兩分子對稱聚集成組蛋白八聚體。146bp長度的DNA雙螺旋盤繞在八聚體上形成核小體。核小體間DNA長度15-100bp（一般60bp）其上結(jié)合有H1 圖2H2A、2H2B、2H3、2H4組蛋白八聚體 146bpDNA 核小體 串聯(lián) 染色質(zhì) 折疊 染色體DNA（直徑2nm） 盤繞組蛋白八聚體上，結(jié)合H1，壓縮比1/7 核小體（一級結(jié)構(gòu)） 螺旋化，壓縮比1/6螺線管（二級結(jié)構(gòu)） 再螺旋化，壓縮比1/40超螺線管（三級結(jié)構(gòu)） 折疊，壓縮比1/5染色單體（四級結(jié)構(gòu)） 總壓縮比：1/84001/10000六、 DNA的生物學(xué)功能首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 P3

16、42 14 Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第三節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)一、 RNA的一級結(jié)構(gòu)RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通過3/、5/磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。P343 圖5-10 RNA基本結(jié)構(gòu) 組成RNA的戊糖是核糖 堿基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中還有一些稀有堿基。 天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋區(qū)一般占RNA分子的50%左右。二、 RNA的類型細(xì)胞中的RNA，按其在蛋白質(zhì)合成中所起的作用，主要可分為三種類型。核糖體RNA rRNA 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA tRNA信使 RNA mRNA 此外，真核生物細(xì)胞中有少量核內(nèi)小RNA（small

17、 nuclear RNA snRNA）P344 表5-7 大腸桿菌中的RNA沉降系數(shù)：單位離心場中的沉降速度，以S為單位，即10-13秒。如23S rRNA ，單位離心場中沉降 23×10-13秒 5S rRNA ，單位離心場中沉降 5×10-13秒三、 tRNA的結(jié)構(gòu) tRNA約占全部RNA的15%主要功能：在蛋白質(zhì)生物合成過程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。已知一級結(jié)構(gòu)的tRNA有160種，每種tRNA可運(yùn)載一種特定的a.a，一種a.a可由一種或多種tRNA運(yùn)載。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分子量在25kd左右，70-90b，沉降系數(shù)4S左右堿基組成中有較多稀有堿基 圖3末端為CpCpA-OH，用來接受活化

18、的氨基酸，此末端稱接受末端。5末端大多為pG或pC二級結(jié)構(gòu)是三葉草形P345 圖5-12 tRNA的二級結(jié)構(gòu)（三葉草模型）1966年Crick對于tRNA能識別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對的“擺動(dòng)學(xué)說”：認(rèn)為除A-U、G-C配對外，還有非標(biāo)準(zhǔn)配對，I-A、I-C、I-U，并強(qiáng)調(diào)密碼子的5端第1、2個(gè)堿基嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)配對，而第3個(gè)堿基可以非標(biāo)準(zhǔn)配對，具有一定程度的擺動(dòng)靈活性。四、 mRNA的結(jié)構(gòu)mRNA是從DNA上轉(zhuǎn)錄而來的，其功能是依據(jù)DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的mRNA編碼，細(xì)胞內(nèi) mRNA種類很多，大小不一，每種含量極低。從功能上講，一

19、個(gè)基因就是一個(gè)順反子，原核生物的mRNA是多順反子，真核mRNA是單順反子。順反子：是由順反試驗(yàn)所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。1、 真核mRNA（1）、 3-端有一段約30-300核苷酸的polyA。 PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶對mRNA專一。原核mRNA一般無polyA。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長；而衰老的mRNA，其polyA較短。polyA功能：PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。（2）、 5-帽子帽子5末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷

20、酸與相鄰的一個(gè)核苷酸相連，形成5-5-磷酸二酯鍵。P346 帽子結(jié)構(gòu)帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA?？蔀楹颂求w提供識別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。2、 原核mRNA（多順反子）原核mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5/帽子和3/polyA。舉列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三個(gè)順反子，分別編碼A蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。 圖MS2病mRNA5端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列

21、和核糖體16S的rRNA的3末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)，這種互補(bǔ)序列與mRNA對核糖體的識別有關(guān)。原核mRNA代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。五、 rRNA的結(jié)構(gòu)rRNA占總RNA的80%左右。功能：rRNA是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。大腸桿菌中有三類rRNA（原核）5S rRNA16S rRNA23S rRNA真核細(xì)胞有四類rRNA5S rRNA5.8S rRNA18S rRNA28S rRNA 圖 原核核糖體（rRNA 部分） 圖 真核核糖體（rRNA部分）P346 圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)一、

22、解離性質(zhì)多聚核苷酸有兩類可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。磷酸是中等強(qiáng)度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點(diǎn)在較低的pH范圍內(nèi)。DNA等電點(diǎn) 44.5RNA 等電點(diǎn) 22.5RNA鏈中，核糖C2-OH的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的解離。二、 水解性質(zhì)1、 堿水解室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 圖在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。DNA、RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后降解。2、 酶水解生

23、物體內(nèi)存在多種核酸水解酶RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外一切酶核酸內(nèi)切酶 最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶三、 光吸收性堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收，max=260nm1、 鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。2、 含量計(jì)算1 ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA 或：40ug/mL單螺旋DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸3、 增色效應(yīng)與減色

24、效應(yīng)P347 圖5-15 DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。四、 沉降特性（DNA）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。 P348 圖516 Cs-Cl密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA相對沉降常數(shù)線型雙螺旋分子 1.00松馳雙鏈閉環(huán) 1.14切刻雙鏈環(huán) 1.14單鏈環(huán) 1.14線型單鏈 1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41坍縮 3.0五、 變性、復(fù)性及雜交變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對蛋白質(zhì)來說，核酸可以

25、耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。1、 變性（1）、 變性：核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價(jià)鍵的斷裂稱核酸的降解。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。P350 圖5-18變性過程 熱變性 因素 酸堿變性（pH小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 260nm吸收值升高。 變性后 粘度降低，浮力密度升高。 二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 （2）、 熔解溫度（Tm）或稱熔點(diǎn)：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對應(yīng)的溫度。DNA的Tm一般在7085之間。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNA A260=1.0

26、0，完全變性（單鏈）A260= 1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時(shí)，即1.185時(shí)，對應(yīng)的溫度即為Tm。（3）、 影響DNA的Tm值的因素DNA均一性 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍 內(nèi)。G-C含量與Tm值成正比，G-C含量高，則Tm越高，測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關(guān)系介質(zhì)中離子強(qiáng)度其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。P351 圖5-212、 復(fù)性變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm2025）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性DNA在緩慢冷卻時(shí)（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。DNA

27、片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Co·t衡量。Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時(shí)間，以秒表示。 P352 圖5-22，不同DNA的復(fù)性時(shí)間。A1個(gè)核苷酸對（A.U）圖上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L若濃度為Co=1.0m mol/L則復(fù)性50%所需時(shí)間t=0.004秒若要全部復(fù)性，Cot=10-4 t=0.1秒BE.coli 4.2×106堿基對圖上查出Cot1/2=10 mol.s/L若濃度Co=1.0 umol/L則復(fù)性50%所需時(shí)間t=107秒，約115天。復(fù)性100%Cot=500 mol.s/

28、Lt=5×108秒，5758天。對于E.coli ，4.2×106bp，濃度達(dá)到umol/L級時(shí)，濃度已很高。 復(fù)性機(jī)制：10-20bp成、拉鏈3、 雜交（DNADNA、 DNARNA）將不同來源的DNA混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源DNA之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)會(huì)形成雜交分子。第五節(jié) 核酸研究技術(shù)一、 核酸的分離純化要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。 條件溫和，防止過酸、過堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。1、 DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質(zhì)，可

29、將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。2、 RNA的制備（重點(diǎn)介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對RNA的破壞。二、 核酸的凝膠電泳1、 瓊脂糖電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比 凝膠濃度 DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5V/cm2、 PAGE電泳三、 限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、 限制修飾系統(tǒng) 圖2、 II型核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶有I、II、III三種類型，其

30、中II型酶在DNA克隆中十分有用。II型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對稱（反向重復(fù)）。II型酶的切割頻率識別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536Not I GCGGCCGC限制酶的命名：E.coRI第一位： 屬名E（大寫）第二、三位： 種名的頭兩個(gè)字母小寫co第四位： 菌株R第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號。同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。BamH： GGATCC 同裂酶 BstI識別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。

31、同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BamHI：GGATCC同裂酶：BstI GGATCC同尾酶：BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC星號活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。例如 HindIII AAGCTT四、 DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時(shí)，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖五、 分子雜交1、 Southern BlottingP353 圖5-23DNA樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時(shí)）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位?？捎肈NA或RNA探針。2、 Northern Blotting研究對象是mRNA檢測可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存