環(huán)境工程微生物實(shí)驗(yàn)

1、第一章 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常識(shí)第一節(jié) 微生物實(shí)驗(yàn)操作常識(shí)環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的是：訓(xùn)練學(xué)生掌握微生物學(xué)最基本的操作技能；了解微生物學(xué)的基本知識(shí)；加深理解課堂講授的某些微生物學(xué)理論。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力以及實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度以及勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物的良好作風(fēng)。一、實(shí)驗(yàn)過程中注意事項(xiàng)1每次實(shí)驗(yàn)前必須對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行充分預(yù)習(xí)，以了解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和方法，做到心中有數(shù)，思路清楚。2認(rèn)真及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)記錄，對于當(dāng)時(shí)不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和結(jié)果，以便分析。3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話和隨便走動(dòng)，保持室內(nèi)安靜。4實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)心仔

2、細(xì)，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，萬一遇有盛菌液試管或瓶不慎打破、皮膚破傷或菌液吸入口中等意外情況發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞。5實(shí)驗(yàn)過程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，先關(guān)掉火源，再用濕布或砂土掩蓋滅火，必要時(shí)用滅火器。6使用顯微鏡或其他貴重儀器時(shí)，要求細(xì)心操作，特別愛護(hù)。對消耗材料和藥品等要力求節(jié)約，用畢后仍放會(huì)原處。7每次實(shí)驗(yàn)完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗(yàn)室收拾整齊，擦凈桌面，如有菌液污染桌面或其他地方時(shí)，可用3%來蘇爾液或5%石炭酸液覆蓋其上半小時(shí)后擦去，如系芽孢桿菌，應(yīng)適當(dāng)延長消毒時(shí)間。凡帶菌之工具（吸管、玻璃刮棒等）在洗滌前須先消毒

3、（浸泡在3%來蘇爾液中）。8每次實(shí)驗(yàn)須進(jìn)行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。9每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報(bào)告內(nèi)容中，力求簡明準(zhǔn)確，及時(shí)匯交教師批閱。10離實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗，燈、火、煤氣等。二、接種室在微生物工作中，菌種的接種移植是一項(xiàng)主要操作，這項(xiàng)操作的特點(diǎn)就是要保證菌種純，防止雜菌的污染。在一般環(huán)境的空氣中，由于許多塵埃和雜菌，對接種工作干擾很大，很易污染。因此，接種工作要在空氣經(jīng)過滅菌的環(huán)境里進(jìn)行，小規(guī)模的可利用接種箱，大規(guī)模的則在接種室里操作，也可在超凈工作臺(tái)中操作。（一

4、）接種室內(nèi)設(shè)備和用具接種室內(nèi)的工作臺(tái)，不論是什么臺(tái)面，都要求表面光滑和水平。光滑是便于用消毒藥劑擦洗；水平是在倒瓊脂平板時(shí)可以保證培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度一致。在接種室（或超凈工作臺(tái)）安裝一個(gè)紫光燈。接種室內(nèi)的紫光燈，可吊在經(jīng)常工作的座位的正上方。緩沖室內(nèi)應(yīng)有專用的工作服、鞋、口罩、盛有來蘇兒水的瓷瓶和毛巾、手持噴霧器和5石炭酸溶液等。接種室內(nèi)有酒精燈、常用接種工具、不銹鋼制的刀、剪、鑷子、70的酒精棉球、工業(yè)酒精、載玻片、記錄本、標(biāo)簽紙、廢物筐等。（二）接種室的滅菌消毒1熏蒸滅菌：接種室使用時(shí)間較長，污染比較嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌?？捎眉兹?、乳酸或硫磺熏蒸。熏蒸前應(yīng)將接種室清掃干凈，打開通氣窗通風(fēng)干

5、燥。這是接種室徹底滅菌的措施。2石炭酸噴霧：在每次接種前，用5石炭酸噴霧，可促使空氣中微粒及雜菌沉降，防止桌面、地面上微塵飛場，并有殺菌作用。3紫外線照射：有條件時(shí)在每次接種前，應(yīng)開啟紫外線燈，照射半小時(shí)以上（一般不必超過一小時(shí)），有較好的殺菌效果。（三）接種室工作程序1每次使用前半小時(shí)，接種室和緩沖室內(nèi)用5石炭酸噴霧。有紫外線燈時(shí)可照射半小時(shí)。2用肥皂洗手。把所需器材搬入緩沖室。換上經(jīng)常滅菌的工作服、工作帽和工作鞋（舊的衣帽鞋洗干凈后滅菌即可），戴好口罩，然后用2煤酚皂液將手浸洗2min。3將各種需用物品般進(jìn)接種室，按一定位置放好。檢查是否齊備。用5石炭酸重點(diǎn)在工作臺(tái)面上方和附近地面上噴霧，

6、然后退回隔離室，稍停幾分鐘，再進(jìn)接種室工作。4接種操作前用70%酒精棉球擦手，進(jìn)行無菌操作時(shí)，要嚴(yán)格認(rèn)真，動(dòng)作要輕緩，盡量減少空氣波動(dòng)，如二人操作，要相互配合好。工作時(shí)用完的火柴、廢紙等，不要仍在地上，應(yīng)丟道廢物桶內(nèi)。5工作結(jié)束后，立即將臺(tái)面收拾干凈，將不應(yīng)在接種室存放的物品和廢棄物全部拿出接種室，然后用5%石炭酸全面噴射，開紫外線燈照射半小時(shí)。6工作中應(yīng)主要安全。如遇棉塞著火，用手緊握即可熄火，如來不及時(shí)，應(yīng)用濕布撲滅，切勿用嘴吹，以免擴(kuò)大燃燒；如遇有菌培養(yǎng)物灑落或打碎有菌容器時(shí)，應(yīng)用抹布沾5石炭酸收拾到廢物桶內(nèi)并擦拭臺(tái)面或地面，用酒精棉球擦手后再繼續(xù)操作。（四）接種室空氣污染情況的檢驗(yàn)接種

7、室應(yīng)定期進(jìn)行空氣污染情況的檢驗(yàn)，其目的是了解接種室滅菌效果，另外是了解在操作過程中操作行動(dòng)對空氣的污染影響，以便有的放矢地及時(shí)改進(jìn)滅菌措施和操作方法。1檢驗(yàn)方法（1）平板檢驗(yàn)法：用培養(yǎng)微生物主要類群的常規(guī)培養(yǎng)基，如肉湯瓊脂、淀粉瓊脂、土豆瓊脂，分別倒成平板，每種兩個(gè)，都放入接種室內(nèi)。檢驗(yàn)時(shí)，按無菌操作各將其中一個(gè)平板的蓋子打開，經(jīng)過預(yù)定時(shí)間后再行蓋好，另外一個(gè)不開蓋子的作為對照，一起放入30環(huán)境培養(yǎng)，48h后檢驗(yàn)有無菌落生長。（2）斜面培養(yǎng)法將常用的瓊脂斜面（與上相同）各取2管，放入接種室。按無菌操作各將其中的一管打開棉塞，將棉塞放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)。經(jīng)過預(yù)定時(shí)間后，再將棉塞通過火焰塞好試管。連

8、同對照一起培養(yǎng)，48h后檢驗(yàn)有無雜菌生長。2檢驗(yàn)方法（1）空氣滅菌后的檢驗(yàn)：接種室用甲醛或其它藥劑熏蒸后，在開始使用前半小時(shí)或一小時(shí)打開培養(yǎng)皿蓋子，至使用接種室時(shí)蓋好。其目的是為了檢驗(yàn)接種室內(nèi)空氣滅菌的效果。（2）操作過程中空氣污染情況的檢驗(yàn)：為了檢驗(yàn)在使用接種室的過程中，由于人員的進(jìn)出、器材的搬放、接種操作的動(dòng)作等原因造成的空氣污染的情況，可在淮備工作結(jié)束后接種操作開始時(shí)打開蓋子，經(jīng)5分鐘、30分鐘或直到工作結(jié)束時(shí)再蓋好，以檢驗(yàn)在不同的使用時(shí)間內(nèi)空氣污染的程度。（3）紫外線滅菌效果的檢驗(yàn)：接種室用紫外線燈照射后，可在不同高度和不同位置用瓊脂平板檢驗(yàn)空氣中的雜菌，以判斷紫外線的滅菌效果。必要時(shí)

9、應(yīng)調(diào)整照射時(shí)間或紫外線燈的高度。3檢驗(yàn)結(jié)果分析：檢驗(yàn)用的平板或斜面，在30培養(yǎng)48h后，檢驗(yàn)是否長有菌落、菌落數(shù)量、并由菌落形態(tài)判斷雜菌的種類。一般要求平板開蓋5分鐘者應(yīng)不超過3個(gè)菌落；斜面開塞30分鐘者應(yīng)不長菌落為合格。從空氣中雜菌的種類可以考慮采取有效措施，增進(jìn)滅菌效果。如霉菌較多，可先用5石炭酸滅菌后，再用甲醛熏蒸；如細(xì)菌較多時(shí)，可采用乳酸與甲醛交替熏蒸的辦法。第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)室常用顯微鏡自從17世紀(jì)荷蘭人列文虎克發(fā)明了顯微鏡后，人類才第一次看見了細(xì)菌。本世紀(jì)30年代，電子顯微鏡的問世，人類才真正地揭示了微觀世界的奧妙，不但看到了細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)，而且也弄清了超微生物病毒的真正面目。40年代

10、層析技術(shù)的分離和電泳技術(shù)的出現(xiàn)和興起，大大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的研究，諸如核酸、酶、蛋白質(zhì)分子的分離、分析和分子的結(jié)構(gòu)的測定。近幾十年來，紅外光譜、紫外光譜和質(zhì)譜、核磁共振波譜等技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，弄清了許多有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)。隨著激光、超導(dǎo)等技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，將把微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)推向一個(gè)嶄新的水平。一、顯微鏡人眼觀察物體的能力是有限的。一般情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.10.2mm的兩個(gè)物體。也就是說，當(dāng)兩個(gè)物體相距不到0.1mm時(shí)，人眼也就把它們看成是一個(gè)物體了。這個(gè)極限稱為人眼的分辨力。由此可知，人眼對小到一定距離的物體，如普通的細(xì)菌，就只能是“視而不見”。自從顯微鏡發(fā)明后，

11、變產(chǎn)生了微生物學(xué)，它大大地推動(dòng)了生物科學(xué)的發(fā)展，使人類從宏觀世界走向微觀世界。（一）光學(xué)顯微鏡1、普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械部分和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分所組成。機(jī)構(gòu)部分包括：鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)等；光學(xué)部分包括：目鏡、物鏡、聚光器、反光鏡和光源等。普通光學(xué)顯微鏡的特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、成像清晰、價(jià)格低廉、種類繁多、用途十分廣泛。2、暗視野顯微鏡若將普通光學(xué)顯微鏡的聚光器換成暗視野聚光器，就可變?yōu)橐患馨狄曇帮@微鏡。從暗視野顯微鏡目鏡中觀察，視野全是黑暗的，只有被檢物體（細(xì)菌）才是明亮的。由于所見到的菌體僅僅是個(gè)輪廓，而看不清其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，故只能在觀察菌體時(shí)使用。3、熒光顯微鏡

12、熒光顯微鏡與暗視野顯微鏡的結(jié)構(gòu)是相同的，只是把普通光源換成一個(gè)激發(fā)熒光的紫外光源，紫外光光源通常采用高壓汞燈。熒光顯微鏡主要用于科研、教學(xué)、醫(yī)藥和微生物等研究工作中。4、相差顯微鏡如果要觀察透明的活體微生物，由于光線透過它時(shí)光的波長和振幅不發(fā)生變化，所以整個(gè)視野的亮度是均勻的，因而一般的顯微鏡不能分辨出微生物細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。若采用相差顯微鏡即可彌補(bǔ)上述不足。相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)除了與普通顯微鏡一樣外，所不同的是在聚光器下方插入了一個(gè)環(huán)狀光欄，另有幾個(gè)安裝相板的相差物鏡及合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡三個(gè)特殊部分。國內(nèi)常用的有：XSX-1型與XSX-2型相差顯微鏡（南京江南光學(xué)儀器廠產(chǎn)品）。相差顯微鏡主要用于科研、

13、教學(xué)、醫(yī)療等部門作細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)的研究觀察。5、偏光顯微鏡在生物體中，某些組織成分由于光學(xué)性質(zhì)不同，可不經(jīng)染色，利用偏光來加以區(qū)別。偏光顯微鏡就是利用它的特殊裝置偏光器、檢偏器和補(bǔ)償器等，使在鏡檢時(shí)產(chǎn)生偏光以鑒別細(xì)微結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以辨別組織中的化學(xué)成分，因此可用于組織化學(xué)的研究中。6、紫外光顯微鏡該鏡是以紫外光為光源。由于被檢物體內(nèi)各種組分對紫外光吸收能力不同，因此，在以紫外光顯微鏡鏡檢時(shí)，可使未染色的標(biāo)本容易辨別。同時(shí)，又因紫外光的波長比可見光要短一半，從而使它的分辨力增加了兩倍，所以能看到用染色方法所看不到的結(jié)構(gòu)。該鏡對核酸的研究尤為重要。（二）電子顯微鏡電子顯微鏡的一切性能都是光學(xué)顯微鏡

14、不能比擬的。光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)只有兩千倍，而電子顯微鏡的放電倍數(shù)則為一百多萬倍。目前，電子顯微鏡技術(shù)（electron microscopy)已成為研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)的重要手段。常用的有透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）。與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見光，用電磁透鏡代替了光學(xué)透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。電子顯微鏡不但放大能力強(qiáng)，而且分辨率高，光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2m，而電子顯微鏡的分辨率已達(dá)到0

15、.3nm。一般原子的間距大約為0.1nm，因此電子顯微鏡可以觀察到原子世界。這個(gè)分辨率比光學(xué)顯微鏡提高了3000多倍。電子顯微鏡主要由電子發(fā)射源（又稱電子槍）、會(huì)聚透鏡、接物透鏡、投射透鏡、記錄系統(tǒng)、高壓電源與低壓電源、真空系統(tǒng)等七大部分組成。1、掃描電鏡掃描電鏡是用極細(xì)的電子束在樣品表面掃描，將產(chǎn)生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運(yùn)送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細(xì)胞、組織）表面的立體構(gòu)像，可攝制成照片。掃描電鏡樣品用戊二醛和餓酸等固定，經(jīng)脫水和臨界點(diǎn)干燥后,再于樣品表面噴鍍薄層金膜，以增加二波電子數(shù)。掃描電鏡能觀察較大的組織表面結(jié)構(gòu)，由于它的景深長，1mm左右的凹凸不平面能清所成

16、像，故放樣品圖像富有立體感。2、透射電鏡透射電鏡是以電子束透過樣品經(jīng)過聚焦與放大后所產(chǎn)生的物像， 投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。透射電鏡的分辨率為0.10.2nm，放大倍數(shù)為幾萬幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50100nm）。其制備過程與石蠟切片相似，但要求極嚴(yán)格。要在機(jī)體死亡后的數(shù)分鐘內(nèi)取材，組織塊要小(1立方毫米以內(nèi)），常用戊二醛和鋨酸進(jìn)行雙重固定樹脂包埋,用特制的超薄切片機(jī)（ultramicrotome）切成超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛等進(jìn)行電子染色。電子束投射到樣品時(shí)，可隨組織構(gòu)成成分的密度不同而發(fā)生相應(yīng)的電子發(fā)射，如

17、電子束投射到質(zhì)量大的結(jié)構(gòu)時(shí)，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。稱電子密度高（electron dense）。反之，則稱為電子密度低（electron lucent）。（三）顯微攝影要拍一張高質(zhì)量的微生物照片，必須具備圖像清晰、分辨率高的顯微鏡和優(yōu)良的攝影機(jī)，這兩者是最為重要的，然后配合以適當(dāng)?shù)恼彰骱褪炀毜牟僮骷记?，就可以拍到一張滿意的顯微照片。任何一種顯微鏡都可以用于顯微攝影，不屬哪一種適用、哪一種不適用的問題，但常用的還是普通的明視野顯微鏡。如果要拍攝一張高質(zhì)量的顯微照片，最好使用高分辯率的顯微鏡。第三節(jié) 滅菌與滅菌器滅菌是專指用化學(xué)

18、或物理的方法殺死和除去全部微生物因此，滅菌后無任何活的微生物。其主要包括一切細(xì)菌、芽孢、霉菌、病毒等。在微生物的實(shí)驗(yàn)和研究工作中，不論是培養(yǎng)基，還是所使用的一切器具，都必須經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌后，方能進(jìn)行工作。滅菌的方法很多，常用的有化學(xué)法與物理法。物理法中又包括高溫滅菌法、輻射滅菌法與過濾除菌法等。這里介紹常用幾種滅菌器械：一、高壓滅菌器高壓滅菌器是一個(gè)密閉的、可以耐受壓力的金屬鍋，通以蒸汽，蒸汽不能向外擴(kuò)散，就使滅菌器內(nèi)壓力不斷升高，水的沸點(diǎn)也不斷升高，這樣就可以獲得比100更高的溫度。如在每平方厘米為一個(gè)大氣壓（即15磅平方英寸）的壓力下，溫度可達(dá)121，一般只要維持1520分鐘就可殺死一切微

19、生物的營養(yǎng)體和它們的各種孢子。高壓滅菌器有立式，臥式和手提式等數(shù)種類型。二、干熱滅菌箱干熱滅菌箱就是電熱烘箱，滅菌時(shí)使電熱烘箱保持恒溫，所以又稱熱空氣滅菌。這種滅菌器適于各種各樣的耐熱玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、試管、移液管等）和某些其它物品（如石蠟油）的滅菌，一般在160下，持續(xù)1小時(shí)，就可以達(dá)到滅菌的目的。三、細(xì)菌過濾器過濾除菌法是將帶菌的液體或氣體通過一個(gè)過濾器，使細(xì)菌受到機(jī)械阻留而隔留在濾板上，從而達(dá)到除菌的目的。第二章 微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn) 1 光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理，學(xué)習(xí)顯微鏡的操作方法和保養(yǎng)2學(xué)習(xí)并掌握油鏡的使用技術(shù)3觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)，

20、學(xué)會(huì)生物圖的繪制4. 觀察觀察酵母菌、霉菌個(gè)體形態(tài)二、實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、蓋玻片、載玻片、香柏油、細(xì)菌示范片、擦鏡紙細(xì)菌示范片；酵母菌示范片；霉菌示范片等三、顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡分機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩部分。如圖1-1所示。圖1-1 顯微鏡的結(jié)構(gòu)1目鏡；2目鏡筒；3鏡臂；4粗調(diào)手輪；5微調(diào)手輪；6移動(dòng)尺；7物鏡轉(zhuǎn)換器；8物鏡；9載物臺(tái)；10聚光鏡；11 可變光欄；12反射鏡；13底座（一）顯微鏡的機(jī)械裝置1鏡筒 鏡筒上端裝目鏡，下端接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒和雙筒兩種。本實(shí)驗(yàn)采用的是單筒顯微鏡。鏡筒長度一般是160mm。2轉(zhuǎn)換器 轉(zhuǎn)換器裝在鏡筒的下方，其上有3個(gè)孔，有的有4個(gè)或5個(gè)孔。不同規(guī)格的物鏡分別安裝

21、在各孔上。3載物臺(tái) 載物臺(tái)為方形，中央有光孔，孔的兩側(cè)各裝1個(gè)標(biāo)本夾片，載物臺(tái)上還有移動(dòng)器，其上有刻度尺。移動(dòng)器可縱向和橫向移動(dòng)，其作用是夾住和移動(dòng)標(biāo)本。4鏡臂 鏡臂支撐鏡筒、載物臺(tái)、聚光器和調(diào)節(jié)器。鏡臂有固定式和活動(dòng)式兩種。本試驗(yàn)所用顯微鏡的鏡臂為活動(dòng)式。5鏡座 鏡座為馬蹄形，支撐整臺(tái)顯微鏡，其上有反光鏡。6調(diào)節(jié)器 調(diào)節(jié)器包括大、小螺旋調(diào)節(jié)器（調(diào)焦距）各一個(gè)。可調(diào)節(jié)物鏡和所需觀察的物體之間的距離。調(diào)節(jié)器裝在鏡臂上方，通過升降鏡筒來調(diào)焦距。（二）顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)1目鏡 每臺(tái)顯微鏡備有3個(gè)不同規(guī)格的目鏡，其上刻有5×、10×、16×等數(shù)字和符號，意指使用時(shí)可放大5倍

22、、10倍和16倍。2物鏡 物鏡裝在轉(zhuǎn)換器孔上，可分低倍鏡、高倍鏡和油鏡三種，其相應(yīng)的放大倍數(shù)常是10、40（或45）、100（或90）。通常顯微鏡的放大倍數(shù)等于物鏡放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積。例如，用放大40倍的物鏡（高倍鏡）與放大16倍的目鏡時(shí)所得的物像的放大倍數(shù)為40×16640倍。在使用低倍鏡和高倍鏡時(shí)，標(biāo)本和物鏡之間的介質(zhì)時(shí)空氣。油鏡的放大倍數(shù)通常為100倍，使用油鏡時(shí)，物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)是香柏油，即在標(biāo)本上滴上一滴油，再將油鏡浸沒在油中。3聚光器 聚光器在載物臺(tái)的下面，反光鏡反射來的光線通過聚光器被聚集成光錐照射到標(biāo)本上，可增強(qiáng)照明度，提高物鏡的分辨率。聚光器可以上下

23、調(diào)整，中央裝有光圈，用以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。當(dāng)光線過強(qiáng)時(shí)，應(yīng)縮小光圈或把聚光器向下移動(dòng)。4反光鏡 反光鏡裝在鏡座上，有平、凹兩面，光源為自然光時(shí)用平面鏡，光源為燈光時(shí)用凹面鏡。它可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)方向。反光鏡可反射光線到聚光器上。 四、油鏡物鏡的基本原理一般在鏡頭上有一白圈或紅圈的，表示為油鏡物鏡，也有的以“OI”或“HI”字樣來表示。使用時(shí)，油鏡物鏡與其它物鏡的不同是載玻片與物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生曲折。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過

24、玻片后，受到曲折，發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就降低了視野的照明度。如圖1-2所示。圖1-2 物鏡干燥系（a）與油浸系（b）光線通路圖1-3 物鏡的光線入射角利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑（N.A.），因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂的數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：N.A.=n sin/2 N.A.=數(shù)值孔徑n介質(zhì)折射率最大入射角，即鏡口角。因此，光線投射到物鏡的角度越大，顯微鏡的效能就越大（圖1-3），該角度的大小是由物鏡的直徑和焦距決定的。n是影響數(shù)值

25、孔徑的因素，n值越大，數(shù)值孔徑也越大。如光線入射角為120°，其半數(shù)的正弦為sin60°0.87，由圖1-4可知，而n空氣1，n水1.33，n香柏油1.52，n玻璃1.52，則：以空氣為介質(zhì)時(shí)：N.A.=1×0.870.87以水為介質(zhì)時(shí)：N.A.1.33×0.871.15以香柏油為介質(zhì)時(shí)：N.A.1.52×0.871.32圖1-4 油浸作用顯微鏡的性能還依賴于物鏡的分辨率，分辨率是指顯微鏡能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。分辨率用表示。0.61×/N.A. （式中為波長）它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長度成反比，因此，物鏡的數(shù)值孔徑越

26、大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨率越大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也越能更明晰地區(qū)別出來。事實(shí)上可見光的波長（0.380.7m）是不可能縮短的，只有靠增大數(shù)值孔徑來提高分辨率。五、顯微鏡的操作步驟（一）觀察前的準(zhǔn)備1置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約為一寸左右。鏡檢者姿勢端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時(shí)睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。2調(diào)節(jié)光源，對光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如室內(nèi)光線不足或陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。調(diào)節(jié)光源時(shí)，先將光圈完全開放，升高聚光器至載物臺(tái)同樣高，否則使用油鏡時(shí)光線較暗。然后轉(zhuǎn)

27、下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，反光鏡有凹平面，光線較強(qiáng)的天然光源，宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。在對光時(shí)，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢查染色標(biāo)本時(shí)，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時(shí)，光線不宜太強(qiáng)?？赏ㄟ^擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。（二）低倍鏡觀察檢查的標(biāo)本須先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。1旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡移到鏡筒正下方，和鏡筒對直。2轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡向著光源處，同時(shí)用眼對準(zhǔn)目鏡仔細(xì)觀察，使視野亮度均勻。3將標(biāo)本片放在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)移動(dòng)器使觀察的目的物置于圓孔的正中央。4將粗調(diào)節(jié)器向下旋轉(zhuǎn)，眼睛注視物鏡，以

28、防物鏡和載玻片相碰。當(dāng)物鏡的尖端距載玻片約0.5cm處時(shí)停止旋轉(zhuǎn)。5左眼向目鏡里觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)目s小光圈，否則只見光亮一片，難見到目的物。同時(shí)將粗調(diào)節(jié)器慢慢向上旋轉(zhuǎn)，如果見到目的物，但不十分清楚，可用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，至目的物清晰為止。6如果粗調(diào)節(jié)器旋得太快，超過焦點(diǎn)，必須從第4步重調(diào)，不應(yīng)正視目鏡情況下調(diào)粗調(diào)節(jié)器，以防沒把握的旋轉(zhuǎn)使物鏡與載玻片相碰撞壞。7觀察時(shí)兩眼同時(shí)睜開。單筒顯微鏡應(yīng)習(xí)慣用左眼觀察，以便繪圖。（三）高倍鏡的觀察1先用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后再將高倍鏡移至視野正中處。2旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器換高倍鏡，眼睛要在側(cè)面觀察，如果高倍鏡觸及載玻片立即停止旋動(dòng)，說明原來低倍鏡就沒有調(diào)準(zhǔn)焦距，目的物

29、并沒有找到，要用低倍鏡重調(diào)。如果調(diào)對了，換高倍鏡時(shí)基本可以看到目的物。若有點(diǎn)模糊，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)就清晰可見。若視野較暗可適當(dāng)調(diào)節(jié)光圈。3在視野中找到最適宜于觀察的部位，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。（四）油鏡觀察1如果用高倍鏡目的物未能看清，可用油鏡。在用油鏡觀察前，必須先用低倍鏡和高倍鏡檢查標(biāo)本片，將目的物移到視野正中。2將高倍鏡移至一側(cè)，在載玻片上標(biāo)本的鏡檢部位滴一滴香柏油（或液體石蠟），側(cè)面觀察，將油鏡移至正中使油鏡頭浸沒在油中，剛好貼近載玻片。應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)片上，更不能用力過猛，否則不僅壓碎玻片，還會(huì)損壞鏡頭。3從目鏡觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用細(xì)調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐

30、上升，直至出現(xiàn)清晰物像為止。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下剛好貼近載玻片，重復(fù)操作至物像看清為止。4觀察細(xì)菌的示范片，用鉛筆繪出其形態(tài)圖。5觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再蘸取少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其它紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。6將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。六、微生物形態(tài)觀察（一）細(xì)菌的觀察取細(xì)菌觀察片，依次用低倍鏡、高倍鏡，確定適宜的觀察視野。然后用油鏡觀察，并在油鏡狀態(tài)

31、下觀察細(xì)菌具體形態(tài)，并繪制生物圖。（二）酵母菌的觀察酵母菌是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯分化，菌體比細(xì)菌較大。繁殖方式也比較復(fù)雜：無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母菌是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過結(jié)合產(chǎn)生子囊孢子。用美藍(lán)染色制成水浸片，不僅可觀察其外形，而且可以區(qū)分死活細(xì)胞。取酵母菌觀察片，先用低倍鏡，觀察酵母菌的基本形態(tài)，然后用高倍鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)。并繪制酵母菌形態(tài)圖。（三）霉菌的觀察霉菌屬真核微生物，是絲狀真菌的通稱，菌絲較粗，分為營養(yǎng)菌絲及氣生菌絲。營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)或匍匐生長在營養(yǎng)基的表面；氣生菌絲生長在培養(yǎng)基上方的空氣中，長出分生孢子梗和分生孢子。霉

32、菌的菌絲直徑約310m，在顯微鏡下放大100倍清晰可見，放大400倍則細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)也能看見。多數(shù)霉菌的菌絲有隔膜，將菌絲分隔成多細(xì)胞。取霉菌觀察片，先用低倍鏡，觀察霉的基本形態(tài)和特點(diǎn)，然后用高倍鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)。并繪制霉菌形態(tài)圖。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別繪出觀察到的標(biāo)本片的形態(tài)，同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。實(shí)驗(yàn)記錄表：微生物形態(tài)觀察倍數(shù)微生物形態(tài)圖細(xì)菌的觀察酵母菌的觀察霉菌的觀察八、思考題用油鏡觀察時(shí)應(yīng)特別注意些什么？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用? 附錄 顯微鏡的保養(yǎng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)是顯微鏡的主要部分，尤其是物鏡和目鏡。一架顯微鏡的機(jī)械裝置雖好，但光學(xué)系統(tǒng)不好，這架顯微鏡是不會(huì)

33、起好作用的。因此，對顯微鏡要妥善保管。1避免直接在陽光下曝曬，因?yàn)橥哥R與透鏡之間，透鏡與金屬之間都是用樹脂或亞麻仁油粘合起來的。金屬與透鏡膨脹系數(shù)，受高熱因膨脹不均，透鏡可能脫離或破裂，樹脂受高熱溶化，透鏡也會(huì)脫落。2避免和揮發(fā)性藥品或腐蝕性酸類一起存放，碘片、酒精、醋酸、鹽酸和硫酸等對顯微鏡金屬質(zhì)機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)都是有害的。3透鏡要用擦鏡紙擦拭，若僅用擦鏡紙擦不凈，可用擦鏡紙蘸二甲苯擦拭，但用量不宜過多，擦拭時(shí)間也不宜過長，以免粘合透鏡的樹脂被溶化，而使透鏡脫落。4不能隨意拆卸顯微鏡，尤其使物鏡、目鏡、鏡筒不能隨意拆卸，因拆卸后空氣中灰塵落入里面引起生霉。機(jī)械裝置經(jīng)常加潤滑油，以減少因摩擦

34、而受損。5避免用手指沾抹鏡面，否則會(huì)影響觀察，沾有有機(jī)物的鏡片，時(shí)間長了會(huì)生霉，因此，每使用一次，所有的目鏡和物鏡都得用擦鏡紙擦凈。6顯微鏡放在干燥處，鏡箱內(nèi)要放硅膠吸收潮氣。目鏡、物鏡放在盒內(nèi)并存于干燥器內(nèi)，以免受潮生霉。實(shí)驗(yàn) 2 培養(yǎng)基制備與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備工作。2掌握配置和分裝培養(yǎng)基的方法3掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)。二、儀器與材料1培養(yǎng)皿（d=90mm）10套；試管（20mm×200mm）10支；移液管（10mL）2支，（1mL）4支；錐形瓶(250mL)2個(gè)，（500mL）1個(gè)；燒杯（300mL）1個(gè)，電爐（800w）1個(gè)；玻璃珠30粒；天平；量

35、筒等。2紗布、棉花、牛皮紙（或報(bào)紙）3精密pH試紙6.48.4；10鹽酸；10NaOH；4牛肉膏；蛋白胨；氯化鈉；瓊脂；蒸餾水；5高壓蒸汽滅菌鍋；烘箱；酒精燈；圖8-1吸管的包扎牛皮紙或報(bào)紙吸管三、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素以及水份等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才能表現(xiàn)它們最大生命活力，因此對不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH值范圍。培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同，就它們的物理性狀來分，可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入

36、1.52的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.20.5的瓊脂。 圖8-2 棉塞（a）正確 （b）、（c）不正確 四、操作步驟 (一)玻璃器皿的洗滌和包裝 1洗滌玻璃器皿在使用前必須洗滌干凈。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自來水沖凈。移液管先用洗液浸泡，再用水沖洗干凈。洗刷干凈的玻璃器皿自然晾干或放人烘箱中烘干、備用。2包裝（1）將移液管放在4-5 cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30°夾角，折疊包裝紙包住移液管的尖端(如圖8-1)，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下紙頭折疊打結(jié)。按實(shí)驗(yàn)需要，可單支包裝或多支包裝，待滅菌。（2）用棉塞

37、將試管管口和錐形瓶瓶口部塞住棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在微生物工作中一直普遍使用。棉塞的制作（見圖8-2和圖8-3）：按試管口或錐形瓶口大小估計(jì)用棉量，將棉花鋪成中心厚，周圍逐漸變薄的圓形或方形，對折后卷成卷，一手握粗端，將細(xì)端塞入試管或錐形瓶的口內(nèi)，棉塞不宜過松或過緊，用手提棉塞，以管、瓶不掉下為準(zhǔn)。棉塞四周應(yīng)緊貼管壁和瓶壁，不能有皺折，以防空氣微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞插入2/3，1/3留在管口(或瓶口)外，便于拔塞。試管、錐形瓶塞好棉塞后，用牛皮紙包并用細(xì)繩或橡皮筋捆扎好放在鐵絲或銅絲簍內(nèi)待滅菌。圖8-3 棉塞制作過程（3）培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用牛皮紙

38、或報(bào)紙將10套培養(yǎng)皿(皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對)包好。 圖8-4 培養(yǎng)基的分裝（二）培養(yǎng)基的配置過程1稱量：按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各成份放于燒杯中。 2熔化：向上述燒杯中加入所需要的水量，攪勻，然后加熱使其熔解，如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂熔化的過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所失水份。如果配方中含有淀粉，則需先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀并在火上加熱攪拌然后加足水份及其他藥品，待完全熔化后，補(bǔ)足所失水份。3調(diào)pH值：初制備好的培養(yǎng)基往往不能符合所要求的pH值，故需用pH試紙或酸度計(jì)矯正用10%NaOH或10%HCl調(diào)pH至所需范圍。4過濾：用濾紙

39、或多層紗布過濾，一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。 5分裝：根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管(瓶)口塞上棉塞。分裝裝置如圖8-4。注意不要，使培養(yǎng)基沾染在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。（注：本實(shí)驗(yàn)固體培養(yǎng)基采用滅菌后分裝）（1）液體：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。（2）固體：分裝試管，其裝量為管高的1/5，滅菌后制成斜面（圖8-5）。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。（3）半固體：分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。圖8-5 擺斜面6滅菌：培養(yǎng)基分裝好了以后，塞上棉塞，外面再包一層牛皮紙，便可進(jìn)行滅菌。培

40、養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損培養(yǎng)基的必要成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放37溫室培養(yǎng)24小時(shí)，無菌生長者方可使用。（三）無菌水或稀釋水的制備取500mL錐形瓶盛有200mL自來水或蒸餾水，瓶口用棉塞塞好，并用牛皮紙包扎緊。高壓蒸汽滅菌即可。使用時(shí)用滅菌的吸管吸取。（四）、配制培養(yǎng)基的配方根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇下列配方，其它培養(yǎng)基的配方參看附錄。1肉湯蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；瓊脂 20g；蒸餾水1000mL；pH 7.07.2； 滅菌：1.05kg/cm2；溫度121；維持20min。 2查氏培養(yǎng)基 NaNO3 2g；MgSO4

41、 0.5g；瓊脂 20g； K2HPO4 1g；FeSO4 0.01g；蒸餾水 1000mL；KCl 0.5g；蔗糖 30g；pH 自然滅菌：0.7kg/cm2；時(shí)間：20min。 3淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號）可溶性淀粉 20g；FeSO4 0.5g；KNO3 1g；瓊脂 20g；NaCl 0.5g；K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；蒸餾水 1000Ml； pH 7.07.2滅菌：1.05kg/cm2；時(shí)間：20min。（五）滅菌滅菌與消毒二者含意不同，前者是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物；后者是指消滅病源菌或有害微生物而言。滅菌與消毒的方法很多，但總的可以分為物理法和化學(xué)法兩

42、大類。物理的方法包括加熱滅菌(濕熱滅菌、干熱滅菌)，過濾除菌、紫外線滅菌等?；瘜W(xué)的方法主要是利用有機(jī)或無機(jī)的化學(xué)藥品對實(shí)驗(yàn)室用具和其他物體表面進(jìn)行滅菌與消毒。下面分述各滅菌消毒方法的基本原理及操作步驟。1.紫外線滅菌：紫外線滅菌是用紫外燈管進(jìn)行的。波長為200300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。紫外線的殺菌作用主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA復(fù)制所致。另一方面，空氣在紫外線照射下，可產(chǎn)生臭氧(O3)，臭氧也有一定的殺菌作用。紫外線透過物質(zhì)的能力很差，所以只適用于空氣及物體表面的滅菌，它距照射物以不超過1.2米為宜。 操作方法： 接種室常用紫外光

43、燈作空氣滅菌，為了加強(qiáng)紫外線滅菌的效果，在開燈以前，可以在接種室內(nèi)噴灑石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。接種室內(nèi)的桌面，凳等可用23的來蘇爾擦洗。然后再開紫外光照射30分鐘左右。紫外線對人體也有傷害作用，所以不能直視開著的紫外燈光，也不能在開著燈的情況下工作。 為了檢驗(yàn)紫外線滅菌的效果，可以在滅菌后的接種室內(nèi)，桌上和桌下各放一套已傾入肉湯蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，把皿蓋打開15分鐘然后蓋上，置37培養(yǎng)，如果每個(gè)平皿的菌落不超過4個(gè)，則可認(rèn)為滅菌的效果良好，若菌落很多，則需延長照射時(shí)間或同時(shí)加強(qiáng)其它的措施。 2.加熱滅菌 加熱滅菌包括濕熱和干熱兩種，濕熱

44、滅菌又可分成高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸消毒等，干熱滅菌又可分成直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌等。但無論哪種加熱的方法，其基本原理是一樣的，即通過不同的加熱方法使細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與蛋白質(zhì)中含水量的多少有關(guān)，含水份較多者，其凝固所需要的溫度較低，反之，含水份較少者需較高溫度才能使蛋白質(zhì)凝固，因此殺滅芽孢比殺滅營養(yǎng)體所需要的溫度高。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水份，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，而且當(dāng)蒸汽與被滅菌物體接觸凝成為水時(shí)，又可放出熱量，使溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。 幾種加熱滅菌的操作方法分述如下。1

45、）高壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽來達(dá)到滅菌的目的，其溫度在100以上，有強(qiáng)大的殺菌能力。滅菌時(shí)是用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行的。微生物實(shí)驗(yàn)所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基（不耐高溫者除外）等都可用此法滅菌。高壓蒸汽鍋是耐一定壓力的密閉金屬鍋，有立式和臥式兩種。滅菌鍋上附有壓力表、排氣閥、安全閥等。本實(shí)驗(yàn)室滅菌鍋是電源加熱。其操作方法：（1）加水： 打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加入適量的水?；驈募铀谔幖铀脲亙?nèi)。 （2）裝鍋： 加水后，將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，以免影響蒸氣的流通和滅菌效果。然后關(guān)嚴(yán)鍋蓋，對角式均勻旋緊螺旋，打開排氣閥。（3）點(diǎn)火：打開電源開關(guān)，加熱。（4）關(guān)閉排氣閥：待

46、鍋內(nèi)水沸騰后，則視排氣閥排出蒸汽相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)，可關(guān)閉排氣閥。此時(shí)蒸汽將鍋內(nèi)冷空氣驅(qū)凈。（5）升壓、升溫：關(guān)閉排氣閥以后，鍋內(nèi)成為密閉系統(tǒng)，蒸汽不斷增多，壓力計(jì)和溫度計(jì)的指針上升，當(dāng)壓力達(dá)到1.05kg/cm2（溫度為121）即滅菌開始，這時(shí)調(diào)整火力大小使壓力維持在1.05kg/cm21530min。除含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2壓力外，一般都用1.05kg/cm2壓力。（6）中斷熱源：達(dá)到滅菌時(shí)間要求后停止加熱，任其自然降壓，當(dāng)指針回到“0”時(shí)，打開排氣閥（請注意，排氣閥不能過早打開，否則培養(yǎng)基因壓力突降，溫度沒下降而使培養(yǎng)基翻騰沖到棉塞處，既損失培養(yǎng)基有玷污了棉塞）。（7）出鍋：

47、排氣完畢，即可扭松螺旋柄使鍋蓋松動(dòng)。此時(shí)應(yīng)該將鍋蓋提高12cm，并不推開，使用鍋內(nèi)的余熱使棉塞、包頭紙等烘干。1520min后。再推開鍋蓋，取出器物，排掉鍋內(nèi)剩余水。（8）待培養(yǎng)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。若是斜面培養(yǎng)基，從鍋內(nèi)取出后立即擺成斜面，待凝后也放于37培養(yǎng)，若無菌，保存?zhèn)溆谩８邏赫羝麥缇菓?yīng)用最廣的一種滅菌方法，一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本等都可應(yīng)用此法滅菌。但應(yīng)用此法滅菌是否徹底的一個(gè)重要關(guān)鍵是在壓力上升之前，必須先用蒸汽將鍋內(nèi)的冷空氣完全驅(qū)盡，否則，雖然壓力表已指向1.05kg/cm2，但鍋內(nèi)的溫度卻還只有100，結(jié)果往往會(huì)造

48、成滅菌不徹底。2）間歇滅菌 有些培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基等因不耐高溫，故需用間歇滅菌法。間歇滅菌的溫度和時(shí)間是100，30分鐘。這樣的溫度和時(shí)間足以殺死一切細(xì)菌的營養(yǎng)體，但是不能殺死芽孢，因此采用此法滅菌是將待滅菌物經(jīng)第一次滅菌后（100、30分鐘)，取出置溫箱培養(yǎng)，使其中芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)體，第二日再經(jīng)100，30分鐘滅菌，以殺滅發(fā)育的營養(yǎng)體。但恐其中仍有芽孢殘留，因此第三天再經(jīng)培養(yǎng)滅菌，以達(dá)徹底滅菌。此法可用阿諾氏(Arnold)流動(dòng)蒸汽滅菌器或普通蒸籠均可，不需加壓，所以可普遍使用。但因手續(xù)麻煩，時(shí)間長，故一般能用高壓蒸汽滅菌的均不采用間歇滅菌法。3）火焰滅菌直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹

49、底。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的4）煮沸消毒 注射器和解剖器械等，均可用煮沸消毒。其方法是先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)，加水煮沸。一般對于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約1530分鐘即可，但對其芽孢需要延長時(shí)間，往往需煮沸12小時(shí)。如果在水內(nèi)加入2炭酸鈉可促使芽孢死亡，而且可以防止金屬器械生銹。5）干熱滅菌 最簡單的干熱滅菌法是灼燒法，即利用火焰直接把微生物燒死。此法滅菌迅速、徹底，但要焚毀物件，因此使用范圍有限，只適合于接種環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌。實(shí)驗(yàn)

50、室中常用的干熱滅菌法是指用熱空氣滅菌，即把待滅菌的物件均勻地放在恒溫干燥箱內(nèi)；加熱至160170，維持2小時(shí)即可達(dá)到目的。此法只適宜玻璃器皿，金屬用具等的滅菌，但是含有水份的物質(zhì)，如培養(yǎng)基等不可用這種方法。干熱滅菌的操作步驟如下：（1）將包扎好的待滅菌物(培養(yǎng)皿、吸管等)放于箱內(nèi)，注意不要擺得太擠，以免妨礙氣流流通。（2）關(guān)門，插上電源插頭(常為220V)。撥動(dòng)開關(guān)，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器，至紅燈亮。（3）待溫度上升至160170時(shí)，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制，保持此溫度兩小時(shí)。（4）兩小時(shí)后，中斷電源，待溫度降至70以下以后，可開箱門取出滅菌物品，在70以上時(shí)，切勿自行打開箱門。溫度過高，里邊缺氧而易失

51、火，玻璃器皿驟遇冷空氣會(huì)炸裂。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄所配置培養(yǎng)基的名稱、成分、含量、滅菌條件等。并說明該培養(yǎng)基的用途類別主要成分配置體積滅菌條件培養(yǎng)基用途六、思考題1、培養(yǎng)基是依據(jù)什么原理配置成？2、肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中不同成分各起什么作用？3加壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要放盡鍋內(nèi)的冷空氣？滅菌后，壓力表未降低到“0” 時(shí)為什么不可開蓋?4試述高壓蒸汽滅菌滅菌原理和方法。附錄： 其他常用滅菌與消毒方法一、過濾除菌 過濾除菌是用細(xì)菌過濾器進(jìn)行的。 此濾器的過濾板的孔眼非常小，至使細(xì)菌不能通過，故濾液呈無菌。某些不能用熱力滅菌的培養(yǎng)基或其他溶液(如一些抗菌素、血清、疫苗等)可用細(xì)菌濾器除菌。常用的細(xì)菌

52、濾器有蔡氏濾器(Seitz濾器)，玻璃濾器等。蔡氏濾器是用金屬(銀或鋁等)做成的，分為上、下兩節(jié)，過濾時(shí)，用螺旋把石棉板緊緊地夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液置于濾器中抽濾，每次過濾必須用一張新濾板。石棉板濾器因容積大小的不同，而有各種型號。玻璃濾器的濾板是用玻璃粉熱壓而成的，濾板與玻璃漏斗粘合在一起，適用于過濾細(xì)菌的型號是IG 5。反復(fù)加熱滅菌和冷卻，容易使濾板與漏斗之間出現(xiàn)空隙，此濾器就不能用了。過濾除菌操作步驟如下：（1）將過濾器及抽濾瓶等全部裝置，用紙包好，在使用前先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌30分鐘。（2）小心將已滅菌的濾器及抽濾瓶等外面的包紙打開，以無菌操作把濾器安裝于抽濾瓶上。水銀檢壓計(jì)

53、 安全瓶接電力抽氣機(jī)圖9-1 過濾除菌裝置 （3）以橡皮管連接抽濾瓶與安全瓶(中間可連一水銀檢壓計(jì))，再將安全瓶接于真空泵上(圖12-1)。 （4）將待除菌的液體注入濾器內(nèi)，開動(dòng)真空泵即可過濾。 （5）將濾液以無菌操作注入無菌瓶內(nèi)，置37培養(yǎng)24小時(shí)，若無菌生長，可保存?zhèn)溆谩?（6）濾器用畢后，需立即用清水洗滌干凈，然后放在稀鹽酸中浸泡數(shù)小時(shí)，再用清水沖洗干凈，烘干備用。如過濾物是含傳染的物質(zhì)，應(yīng)先浸入2石炭酸溶液中2小時(shí)后再行洗滌。 注意：過濾時(shí)間不宜過長，因低壓能使屈曲運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌通過濾器，但也要避免高度減壓因微小顆粒將堵塞于濾板之內(nèi)，而失去過濾效能。一般以100200毫米水銀柱減壓為限。（

54、四）化學(xué)滅菌 實(shí)驗(yàn)室常用于消毒滅菌的化學(xué)藥劑有如下幾種：1福爾馬林 福爾馬林為甲醛氣體溶于水的溶液。 普通市售的福爾馬林約含甲醛3740，是一種強(qiáng)烈的殺菌劑，可利用其蒸汽或溶液滅菌，其主要作用是使蛋白質(zhì)凝固。10福爾馬林溶液常用于組織標(biāo)本的固定。其蒸汽常用于接種室或培養(yǎng)室的熏蒸滅菌。福爾馬林熏蒸是利用其揮發(fā)所產(chǎn)生的氣體。通常用量按每立方米26毫升計(jì)算，必要時(shí)可再加大用量。揮發(fā)甲醛有兩種方法；一種是直接加熱；一種是氧化。（1）加熱熏蒸 按熏蒸空間計(jì)算，量取甲醛溶液，盛在小鐵筒內(nèi)，用鐵架支好，把酒精燈灌上適量酒精(估計(jì)能蒸干甲醛溶液所需的量，不要超過太多)。將室內(nèi)各種物品準(zhǔn)備妥當(dāng)后，點(diǎn)燃酒精，關(guān)閉

55、室門，任甲醛溶液煮沸揮發(fā)。酒精燈最好能在甲醛蒸完后即自行熄滅。（2）氧化熏蒸 按甲醛液用是的一半稱取高錳酸鉀于一磁碗或玻璃容器內(nèi)，再量取定量的甲醛溶液，室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把甲醛液倒在盛有高錳酸鉀的器皿內(nèi)，立即關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰而揮發(fā)。 高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，當(dāng)它與一部份甲醛液作用時(shí)，由氧化作用產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛液揮發(fā)為氣體。甲醛液熏蒸應(yīng)在使用前至少24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持12小時(shí)以上，再行處理使用。用甲醛液熏蒸對人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用，在相當(dāng)時(shí)間內(nèi)不能進(jìn)室工作，因此應(yīng)在熏蒸后12小時(shí)，量取與甲醛液等量的氨水，迅速放于室內(nèi)，這樣可以減弱對人的刺激作用。2石炭酸(酚) 石炭酸

56、是一種常用的防腐劑或殺菌劑。其主要作用也是使菌體蛋白質(zhì)疑固，而且其滲透力也很強(qiáng)。配成35%的水溶液是一種常用的消毒劑。一般用于接種室內(nèi)噴霧，進(jìn)行桌面、地面和墻壁的消毒。3煤酚皂液(來蘇爾) 煤酚皂也是一種消毒劑，但在水中的溶解度低。和肥皂制成乳濁液可以增強(qiáng)共懸浮性及吸附性，殺菌作用即大為提高。1一2的煤酚皂水溶液常用于無菌操作前洗手消毒(浸泡12分鐘)，或用于室內(nèi)噴霧消毒。也可用3溶液浸泡用過的吸管等玻璃器具(浸泡1小時(shí))。4酒精(乙醇) 酒精也是常用的消毒劑，其殺菌力隨其濃度不同而有變化：濃度過高(95100)的乙醇接觸菌體后，立即引起菌體表層蛋白質(zhì)凝固而形成了一層保護(hù)膜，使得乙醇分子不能滲入其內(nèi)，影響殺菌效果；濃度過低，則殺菌力減弱。實(shí)驗(yàn)證明，以70