學生拷貝高效液相色譜法

1、第四章 高 效 液 相 色 譜 法 （hplc）high performance liquid chromatography一. 高效液相色譜法的特點：1、高壓2、高效3、高速4、高靈敏度5、應用廣泛hplc 與 gc 共同點：1、色譜的基本理論是一致的2、定性定量原理完全一樣hplc 與 gc 區(qū)別：1、流動相不同2、固定相不一樣3、儀器的結構差別較大二. 高效液相色譜儀的結構1. 高壓輸液系統 p.244 (1) 貯液罐 用于存放流動相，其位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差，應耐腐蝕，盡可能密閉，以防因溶劑易揮發(fā)而引起流動相組分的變化以及空氣中的o2、co2等重新溶于已脫氣的流動相中

2、。(2)、高壓輸液泵 p.245 其產生高壓將流動相送入系統，所以對高壓泵有如下要求：a. 泵體材料能耐化學腐蝕；b. 能在高壓連續(xù)工作；c. 輸出流量范圍寬；d. 輸出流量穩(wěn)定，重復性高 (3) 梯度淋洗裝置 p.2452. 進樣系統 p. 246 它將待分析的樣品注入系統進行分析。目前主要采用六通閥為核心的額進樣器，其有“進樣”和“取樣”兩個位置，當處于“取樣”位置時，流動相不經過樣品管，此時可打開進樣口注入樣品到樣 品管，封上進樣口，然后切換到進樣的位置，流動相就經過樣品管沖洗樣品到色譜柱完成進樣的動作。如果是自動進樣器，則這一切將按程序自動完成取樣、進樣、復位、樣品管路清洗等過程。3.

3、 分離系統（色譜柱） p.246 色譜儀中的分離核心，樣品在此完成分離，故其性能對分析結果起關鍵作用，其主要參數有填料的類型、柱子長度、內徑的大小等。4. 檢測系統 p.247主要用于監(jiān)測經色譜柱分離后的組分濃度的變化，并由數據處理系統繪出圖譜來進行定性和定量分析。理想的液相色譜監(jiān)測器應具備如下特征：靈敏度高；對所有的溶質都有響應；響應對流動相流量和溫度的變化都不敏感；不引起柱外譜帶擴展；線性范圍寬；適用范圍廣。 常用的檢測器有紫外檢測器（uvd）、示差折光檢測器（rid）、電導檢測器（ecd）、熒光檢測器（fd）和蒸發(fā)激光散射檢測器（elsd等。 5. 數據處理系統 色譜分析結果,以前主要采

4、用記錄儀和積分儀來處理.現在幾乎都使用pc機結合色譜工作站來處理數據，大大提高了工作效率和結果的準確性。3. hplc分析常用的幾種色譜分離模式的原理和應用 p.2501.固定相 流動相2.高效液相色譜通常依據溶質（樣品）在固定相和流動相分離過程的物理化學原理來分類，主要有以下幾種色譜分離模式：1)、吸附色譜 2)、分配色譜 3)、離子色譜 4)、體積排阻色譜 （凝膠色譜 ） 5)、親合色譜法 6)、手性色譜法 2). 分配色譜(1)正相色譜：流動相極性小，固定相極性大(2)反相色譜：流動相極性大，固定相極性小各種色譜法的比較方法項目吸附色譜分配色譜離子色譜排阻色譜親合色譜固定相全多孔固體吸附

5、劑鍵合在基體上的鍵合相基團高效微粒離子交換劑具有不同孔徑的多孔凝膠鍵聯在基體上的特異配位體流動相不同極性有機溶劑不同極性有機溶劑和水不同ph的緩沖溶液有機溶劑或一定ph緩沖液可加改性劑的ph緩沖液分離原理吸附Û解吸溶解Û揮發(fā)可逆性離子交換多孔性凝膠的滲透或過濾鑰匙結構絡合物可逆性離解平衡常數吸附系數ka分配系數kp選擇性系數ks分布系數kd穩(wěn)定常數kc主要應用中等分子量的脂溶性化合物大多數的化合物的分離與分析離子型化合物的分離與分析大分子的化合物的分離和分子量測定生物活性物質的分離與分析四. 建立高效液相色譜分析方法的一般步驟準備工作想辦法得到各種信息l 向同行了解是否做過

6、此類樣品，或有否類似樣品的分析方法l 查文獻，如ca(化學文摘)l 儀器制造商的文獻對色譜柱有足夠的了解l 掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用? 要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對分離產物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?1.選擇一種適當的色譜分離模式，見下圖。2.選擇一根合適的色譜柱，包括規(guī)格和填料類型3.選擇適當的色譜分離條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方

7、法，進行分離條件的優(yōu)化，實現下面的結果：    在保證一定分離度的條件下達到最快的分析速度。    在保證分析時間的條件下對難分離物質獲得最大的分離度。4.對獲得的色譜圖進行定性和定量分析。樣品的預處理重要性占樣品分析時間的比例l 樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大l 消耗大量的溶劑及其他化學品實驗的重復性及準確性最差的環(huán)節(jié)ë 影響實驗結果好壞的最重要因素ë 是決定性的步驟樣品預處理常用的方法高速離心過濾、超濾l 去除微粒 過濾膜/過濾裝置 高速離心 大于：10,000g選擇性沉淀樣品衍生

8、反應固相萃?。╯pe）技術液-固萃取 / 液-液萃取l sep-pak樣品處理小柱濃縮樣品確認回收率色譜分離模式的選擇五. hplc分析常用小器具和基本使用方法 1、溶劑過濾器對流動相進行過濾的裝置，同時也完成了脫氣，主要由過濾瓶、真空泵和至少0.45um孔徑的微孔濾膜組成。微孔濾膜有水系、有機系和兩用膜三種，兩用膜價格比較昂貴一些。使用時裝上相應的濾膜，連上真空泵，從上面倒入待過濾流動相，啟動真空泵直至過濾完所需的流動相。2、脫氣裝置除用溶劑過濾器脫氣外，還可用超聲波法和氦驅趕法對已過濾過的流動相進行脫氣處理，操作都很簡單。 3、樣品過濾器由于樣品的量較少，一般就用針頭過濾器和小體積的注射器

9、來過濾樣品，針頭過濾器有直徑為13mm和25mm兩種規(guī)格。 4、固相萃取小柱（spe）主要在樣品預處理時用來去掉干擾的雜質以及對目標化合物的富集，隨著填料的發(fā)展，這種樣品預處理技術應用越來越廣，應用效果越來越理想。在使用時，首先詳細閱讀產品說明書，了解產品特性，結合自己的樣品的相關性質進行條件試驗，找出最優(yōu)化的方法。 5、預柱（保護柱）使用預柱可以達到在線富集、凈化樣品和保護色譜柱的作用，但同時也會引起譜帶的擴寬，為盡可能降低擴寬程度，應該使用與分析柱完全相同的填料填充預柱。 6、在線過濾器用來防止色譜柱堵塞而加在色譜柱前的一個過濾裝置，主要結構就是一片孔徑為0.45um的不銹鋼燒結過濾片，只

10、起過濾作用，故應定期清洗。六.hplc基本故障的分析和處理方法 1、每次使用時，開機后首先看看有沒有漏液的情況，在所有的連接頭部分都有可能，如果是泵頭漏液，就必須更換里面的密封圈，如果是普通的接頭處漏，緊一緊接頭即可，如仍不行就更換接頭。2、其次，看看壓力是否正常。如果壓力一直升高，說明系統有堵塞，這時最好先檢查色譜柱，方法是拆去色譜柱，開機看壓力情況，如正常，則說明色譜柱堵塞，更換或清洗色譜柱；如仍升高，則可能管路堵塞，應從泵后開始按順序一段一段的檢查，清除相關問題。如果壓力升不上去或波動太大先看有無泄露情況，再看系統中有沒有氣泡，如有請先排氣泡；然后再檢查泵頭上的進口單向閥和出口單向閥是否

11、堵塞，如有堵塞請清洗或更換；最后再查泵的密封圈是否損壞，如壞則更換。3、然后，用流動相平衡色譜柱，檢測器預熱足夠長時間后，看基線是否平穩(wěn)，噪音是否太大?；€不穩(wěn)一般由下列因素引起：流動相流量波動；流動相組成發(fā)生變化；檢測器燈的能量不穩(wěn)；色譜柱尚未平衡好、色譜柱損壞或柱效下降等環(huán)境溫度變化太大；電源不穩(wěn)定，最好采用高性能的電源穩(wěn)壓器。 4、 最后，進樣分析.考察分析結果，看結果的重現性如何，峰形如何。保留時間的重現性一般與流動相的穩(wěn)定性、色譜柱的性能等有關，而峰面積或峰高的重現性除了前兩者外，還與進樣技術、檢測器性能等有關。峰形的好壞則主要與系統的死體積、色譜柱的性能、色譜條件的選擇等有關。 七

12、. hplc儀器的日常維護儀器的日常維護非常重要，其可避免故障的高發(fā)生率，提高儀器的使用率和工作效率。以下對高效液相色譜系統的各個部件的常規(guī)維護作一簡單的提示，具體的做法最好詳細參考儀器說明書。 1、貯液器(清潔.濾膜.定期清洗）清潔是保持流動相貯液器正常使用的關鍵，要盡可能的使用hplc級的溶劑和試劑。含有緩沖鹽和非hplc級的流動相一定要經過0.5um的過濾膜過濾以除去其中的微粒物質。改變流動相是應防止交叉污染，陳舊的流動相和用久了的試劑應定期廢棄或用適當的方法保存，避免微生物生長和組分的改變。貯液器內壁要定期清洗。等等。 2、泵（密封墊圈.鹽沉積. hplc級試劑）泵的密封墊圈是最易磨損

13、的部件，其損壞可引起許多系統故障，一旦損壞只能更換，故應采取以下措施來延長墊圈的壽命：每天要把泵中的緩沖鹽洗干凈，防止鹽沉積，泵要浸在無緩沖鹽的溶液或有機溶液中；盡量用hplc級試劑；溶液管前用燒結不銹鋼沉子以過濾微粒物質。另外，要防止因系統堵塞而導致的高壓使柱塞杠折斷或燒毀電機。 3、進樣器停機后要沖洗干凈進樣器內殘留的樣品或緩沖鹽，防止鹽沉積和樣品微粒造成閥轉子面磨損或堵塞，對于手動進樣器應避免尖針頭進樣，防止密封墊損壞。4、色譜柱 主要是防止色譜柱性能的下降，應做到： 溶劑的化學腐蝕性不能太強； 避免微粒在柱頭沉積； 系統的壓力不能太大； 流動相的ph值應在色譜柱正常使用的ph范圍內；

14、最好在柱前使用在線過濾器或加保護柱； 使用合理的方法清洗色譜柱； 根據色譜柱所附的說明書的要求正確保存長 期不用的柱子。色譜柱保護 使用保護柱 儀器在使用完畢，要沖洗整個系統移走系統中緩沖液 過濾所有的溶劑和樣品 柱子在不使用時，兩端密封保存 在適當的溶劑中保存柱子 注意色譜柱的ph值使用范圍 不要高壓沖洗柱子 不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相5、檢測器要保持檢測器的清潔，每天用后連同柱子一起沖洗。提倡不定期用強溶劑反向沖洗檢測池（先拆開柱子，再反接）。防止氣泡卡在池內。注意有效利用檢測器的燈源，不用時不要開燈（預熱時除外）。 8. hplc定性分析和定量分析的方法（與gc的方法相同）定量分析

15、誤差定量分析誤差主要由下面各過程中的失誤引起： 樣品的準備：取樣不具代表性；配制樣品的溶劑不合適；儲藏樣品不當及預處理不合理等。 進樣技術：進樣器的結構，操作人員進樣技術的熟練程度，進樣量的大小等都對色譜分析的結果有影響。 色譜柱的穩(wěn)定性：物理強度好、色譜性能穩(wěn)定的固定相可以減小誤差。 流動相的穩(wěn)定性：流速穩(wěn)定、流動相的組成穩(wěn)定有利于減小誤差。 檢測器的特性：靈敏度、噪音、線性特性、響應信號波動都會導致誤差。 分離度：其主要影響峰高和峰面積測量的準確度從而導致誤差。 峰高法和峰面積法的選擇：定量方法的選擇既能影響準確度，又能影響精確度，下表對兩種方法的選擇進行總結。色譜分析時遇到的問題定量方法

16、的選擇流量波動峰高流動相組成變化峰面積溫度波動峰面積色譜柱超負荷峰面積分離度小峰高峰嚴重拖尾峰面積檢測器時間常數太大峰面積色譜柱柱效下降峰面積九.摸索hplc測定新方法的一般程序（. 建立高效液相色譜分析方法的一般步驟）準備工作想辦法得到各種信息l 向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法l 查文獻，如ca(化學文摘)l 儀器制造商的文獻對色譜柱有足夠的了解l 掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用? 要分離（即制備）的樣品量有多大?

17、要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對分離產物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?1.選擇一種適當的色譜分離模式，見下圖。2.選擇一根合適的色譜柱，包括規(guī)格和填料類型3.選擇適當的色譜分離條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方法，進行分離條件的優(yōu)化，實現下面的結果：    在保證一定分離度的條件下達到最快的分析速度。    在保證分析時間的條件下對難分離物質獲得最大的分離度。4.對獲得的色譜圖進行定性和定量分析。樣品的預處理重要性占樣品分析時間的比例l 樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間占

18、分析的消耗總成本最大l 消耗大量的溶劑及其他化學品實驗的重復性及準確性最差的環(huán)節(jié)ë 影響實驗結果好壞的最重要因素ë 是決定性的步驟樣品預處理常用的方法高速離心過濾、超濾l 去除微粒 過濾膜/過濾裝置 高速離心 大于：10,000g選擇性沉淀樣品衍生反應固相萃取（spe）技術液-固萃取 / 液-液萃取l sep-pak樣品處理小柱濃縮樣品確認回收率 1、資料的收集 2、所需實驗用具的準備 3、色譜條件的摸索（對標準品）。 4. 樣品預處理方法的摸索 5、色譜條件的進一步摸索（對樣品） 6、方法學鑒定。 7、方法驗證十. 樣品預處理物理法：1、過濾法 2、稀釋法 3、濃縮法 4

19、、離心法 5、粉碎法 6、膜分離法 化學法：1.萃取法 2、蒸餾法 3、衍生法 4.皂化法 5.水解法 6.沉淀法等例如：應用高效液相色譜法分析維生素之一維生素色譜法與分離柱分離條件備注維生素a反相色譜、ods-18柱流動相：甲醇水，982。流速：1ml/min。熒光檢測器：ex：325nm,em:470nm，或紫外檢測器：325nm。測定視黃醇維生素a正相色譜、si-60柱流動相：正已烷與正丁醇982。流速： 2ml/min。熒光檢測器：ex：325nm，em：475nm。測定全-反式-和13-順式-視黃醇 -胡蘿卜反相色譜、ods-18柱流動相：乙腈、甲醇和二氯甲烷。75/20/

20、5。流速： 1.5ml/min。紫外檢測器：450nm。測定全-胡蘿卜維生素d正相色譜、si-60柱流動相：正已烷異丙醇991。流速： 1.5ml/min。紫外檢測器：265nm。測定總維生素d維生素d反相色譜、ods-18柱流動相：甲醇水，982，流速： 1ml/min。紫外檢測器：265nm。進樣量：20ul/次可測定維生素d2和d3維生素d正相色譜與反相色譜結合使用流動相：正已烷異丙醇991（正相），甲醇水，982（反相），進樣量：200ul/次（正相）， 20ul/次（反相），紫外檢測器：265nm?？膳懦龢悠冯s質干擾，準確定量維生素k反相色譜、ods-18柱流動相：乙腈甲醇水、702

21、28，流速：2ml/min。紫外檢測器：270nm。進樣量：25ul/次測定維生素k15色譜條件色譜條件1：1色譜柱：普通odsc18柱（4.6×250mm，dp 5um）;2流動相：乙腈：四氫呋喃75:253流速：1ml/min4檢測波長：453nm色譜條件2：1色譜柱：waters胡蘿卜專用柱（4.6×250mm，dp 5um）2流動相：叔丁基甲醚：甲醇：水49:50:43流速：1ml/min4檢測波長：453nm色譜學作業(yè)1. 色譜法定性和定量的依據是什么？ 2. 什么叫程序升溫？它有什么作用？3. 什么叫梯度洗脫？它有什么優(yōu)點？4為什么用分離度r作為色譜柱的總分離效

22、能指標？5. 根據速率理論，色譜柱的板高h由哪些因素決定？試給出最佳流動相流速u最佳和最小板高h最小的計算公式。6. 以固定相和流動相的極性及組分出峰順序說明什么是正相色譜和反相色譜。7. 試比較高效液相色譜法與氣相色譜法這兩種分析法之間的異同，并做簡要說明。8. 在一根3m長的色譜柱上分離一樣品，空氣出峰的時間為1min，組分1和組分2的保留時間分別為14和17min，其中組分2峰底寬度為1min。試計算：(1) 該色譜柱分離組分2的理論塔板數；(2)若完全達到分離，所需的最短柱長為幾米？1. 高效液相色譜儀一般分為幾個部分？從儀器構造、分離原理、應用范圍等方面比較氣相色譜與液相色譜的異同點

23、。2. 在液相色譜中，提高柱效的途徑有哪些？其中最有效的途徑是什么？氨基酸自動分析儀（專一的hplc離子交換色譜） 在農業(yè)上應用很廣1。氨基酸-含有氨基和羧基的有機化合物蛋白質由20種氨基酸以不同長短和不同排列組合而成，因此自然界蛋白質的種類是個天文數字。組成蛋白質的氨基酸有20種自然界aa有上百種（衍生aa，牛黃酸等）八種體內不能合成的，必須由食物供給的必須aa-賴aa，色aa，異亮aa，亮aa，苯丙aa，蛋aa，蘇aa，頡aa。賴aa是動物營養(yǎng)中的第一限制aa（如缺其，其它aa再多也是浪費。）游離狀態(tài)氨基酸-生理體液：血液，尿液，植物細胞液等。2等電點：-蛋白質分子內陰，陽電荷相等時的ph值兩性離子的正，負電荷相等呈中性，偶極離子酸性氨基酸：-cooh 羧基 > -nh +2 氨基堿性氨基酸：-coo- < nh2+3構成蛋白質氨基酸的等電點，從2-10范圍，決定于其結構，氨基酸是兩性物質，在不同ph值，處于不同物質狀態(tài)氨基酸經典定量分析法：茚三酮 + 氨基酸-亞氨酸（柱 后衍生） （天藍色復合物） 顏色深淺與氨基酸含量成正比 570 nm 440 nm （脯氨酸，羥脯氨酸） 可見光檢測器 (紫外， 熒光 檢 測器 ）4分析原理： hplc 離子交換色譜流動相：ph值不同的緩沖溶液柱子：帶磺基（so3）