G-CSF對(duì)兔下腔靜脈球囊損傷后內(nèi)皮修復(fù)的影響

1、G-CSF對(duì)兔下腔靜脈球囊損傷后內(nèi)皮修復(fù)的影響黨曉衛(wèi) 王兆陽(yáng) 喬師師 姚振濤 李林 王亞飛 許培欽【摘要】 目的 觀察粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）對(duì)兔下腔靜脈球囊損傷修復(fù)中血管內(nèi)皮變化的影響。方法 50只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組（n=25）：A組損傷后即刻皮下注射G-CSF 50g/kg，連續(xù)7d；B組損傷后即刻皮下注射生理鹽水（N-S）2ml，連續(xù)7d。兩組均于術(shù)后7d、30d取損傷血管段，HE染色觀察血管損傷及修復(fù)情況，計(jì)算內(nèi)膜（I）、中膜（M）面積比值I/M 以評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生程度。結(jié)果 第7d，A組（0.05640.0303）與B組（0.08080.0428）組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1

2、57）。第30d，A組（0.14620.0993）與B組（0.30980.2154）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043）。病理結(jié)果觀察：兩組球囊損傷后即刻均可見(jiàn)靜脈內(nèi)皮損傷。術(shù)后7天新生內(nèi)膜已經(jīng)形成并增厚，中膜可見(jiàn)梭形平滑肌細(xì)胞排列紊亂。術(shù)后30d A組內(nèi)膜增生明顯受到抑制。結(jié)論 G-CSF可促進(jìn)兔下腔靜脈球囊損傷修復(fù)的再內(nèi)皮化，抑制內(nèi)膜增生，可預(yù)防下腔靜脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生?！娟P(guān)鍵詞】布-加綜合征；球囊；內(nèi)皮損傷；粒細(xì)胞集落刺激因子Influence of Granulocyte colony stimulating factor to the rabbit inferior vena

3、 cava endothelial repair after balloon injury WANG Zhao-yang, DANG Xiao-wei , QIAO Shi-shi, YAO Zhen-tao, LI Lin, WANG YA Fei, XU Pei-qin. Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, ChinaCorresponding auth：DANG xiao-wei，Email：dangxw1001【ab

4、stract】Objective To research the affect of rabbit inferior vena cava vascular endothelial repair after balloon injury by granulocyte colony- stimulating factor (G-CSF). Methods 50 experimental rabbit randomly divided into 2 groups（n=25）,Group A: rabbits were injected daily with 50 g /kg G-CSF for 7

5、days shortly after inferior vena cava(IVC) injury. Group B: rabbits were injected daily with 2ml N-S for 7 days shortly after IVC injury. The animals were killed at 7 and 30 days after balloon denudation.The samples of IVC were harvested for observation damaged vascular repair situation by HE dyeing

6、,count the intima(I) area and membrane(M) area ratio to evaluate intima hyperplasia degree. Results The 7 days of A( 0.05640.0303)and B group(0.08080.0428) I/M ratio comparison, difference was not statistically significant(P=0.157). The 30 days of A(0.14620.0993) and B group(0.30980.2154) I/M ratio

7、comparison, difference have statistical significance(P=0.043). Pathological results observation: two groups of rabbit sacculus immediately after injury were visible artery endothelial stripped. 7days after injury neointimal formation and thickening,the membrane can visible spindle smooth muscle cell

8、 arrangement disorder. 30 days, group A of endometrial hyperplasia significantly suppressed. Conclusion It was found that the G-CSF treated can promote the rabbit inferior vena cava injury vascular re-endothelialization process, inhibit intima hyperplasia, for balloon injury has the repair effect, c

9、an prevent vein of restenosis after injury happened.【Keywords】 Budd-Chiari syndrome; balloon; interv ention injury; granulocyte colony stimulating factor介入球囊擴(kuò)張成形術(shù)已成為布-加綜合征（Budd-Chiari syndrome,B-CS）下腔靜脈膜性閉塞再通的主要治療手段, 但介入治療的復(fù)發(fā)率可達(dá)8.3%1。血管修復(fù)中再狹窄是所有腔內(nèi)血管成形術(shù)的主要復(fù)發(fā)因素。在這一病理過(guò)程中, 血管中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移、增生, 形成增厚的新生內(nèi)膜起著

10、重要作用。研究表明, G-CSF可以動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）到外周血并遷移到血管內(nèi)膜受損部位，促進(jìn)再內(nèi)皮化，抑制內(nèi)膜增生，有效預(yù)防內(nèi)膜損傷后血管再狹窄的發(fā)生2。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察G-CSF對(duì)兔下腔靜脈球囊損傷后內(nèi)皮修復(fù)的影響，探討預(yù)防下腔靜脈球囊損傷后再狹窄的有效方法。材料與方法1、材料：50只大白兔，23月齡，體重（2.300.58）kg，選自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。德國(guó)Lecia顯微照像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）。Biosens Digital Imaging System v1.6。2、兔血管損傷模型的建立：實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前12

11、h禁食，不禁水。以10%的水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉。麻醉平穩(wěn)后，仰面做右旁正中切口，長(zhǎng)度約8cm，找出并游離下腔靜脈肝后段及雙側(cè)髂總靜脈匯合處上方0.5cm，用血管夾臨時(shí)夾閉血管兩端。于雙側(cè)髂總靜脈匯合處上方0.5cm處用穿刺針穿刺下腔靜脈成功后，沿套管送入超滑導(dǎo)絲，直視下在導(dǎo)絲引導(dǎo)下置入直徑10mm球囊，將球囊充氣，直視下可見(jiàn)被球囊擴(kuò)張的血管局部明顯膨隆，重復(fù)牽拉球囊2-3次，使下腔靜脈內(nèi)膜損傷剝脫3，球囊擴(kuò)張部位距穿刺處相距約2cm，撤出導(dǎo)絲及球囊，肝素鹽水沖洗靜脈穿刺處，縫合下腔靜脈，使下腔靜脈內(nèi)血流恢復(fù)，逐層關(guān)腹，紗布敷料包扎術(shù)口。術(shù)后連續(xù)3d每日肌注青霉素80萬(wàn)U預(yù)防感染、肌

12、注肝素鹽水250U預(yù)防下腔靜脈內(nèi)血栓形成。3、實(shí)驗(yàn)分組與處理：將50只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組，n=25：A組（損傷+G-CSF）：下腔靜脈球囊損傷后即刻皮下注射G-CSF50g/kg，連續(xù)7d；B組（損傷+N-S）：下腔靜脈球囊損傷后即刻皮下注射N-S2ml，連續(xù)7d。兩組均于術(shù)后即刻處死5只實(shí)驗(yàn)兔取損傷段血管觀察內(nèi)皮損傷情況；另于術(shù)后7d、30d各處死10只實(shí)驗(yàn)兔并取損傷血管段，方法如下：以10%的水合氯醛5ml/kg靜脈注射過(guò)量處死，沿原切口進(jìn)腹，找到并游離下腔靜脈損傷段（距穿刺部位約2cm處），取其上下長(zhǎng)度約1cm的下腔靜脈段，行甲醛浸泡、石蠟包埋和連續(xù)切片。固定切片后采用常規(guī)HE染色，光鏡

13、下觀察形態(tài)學(xué)變化。將每張切片置于顯微圖像分析儀上，每一個(gè)標(biāo)本連續(xù)測(cè)量3張切片，取其平均值。以內(nèi)彈力膜與內(nèi)腔面之間組織為新生內(nèi)膜，圖像分析儀測(cè)量新生內(nèi)膜面積（I）；以外彈力膜與內(nèi)彈力膜之間組織為中膜，測(cè)量中膜面積（M）。計(jì)算內(nèi)膜中膜面積比值I/M，采用I/M 比值表示內(nèi)膜增生程度，以評(píng)價(jià)再狹窄。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)用（均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。 結(jié) 果1下腔靜脈I/M值變化：7d時(shí)A、B組間I/M值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。30d時(shí)，A與B組間I/M值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）（表1）。表1 2組球囊損傷后不同時(shí)期I/M值比較

14、（s）組別 n7d30dG-CSF處理組 100.05640.03030.14620.0993N-S處理組 100.08080.04280.30980.21542.下腔靜脈內(nèi)膜、中膜損傷修復(fù)病理觀察結(jié)果：光鏡下正常兔下腔靜脈脈內(nèi)膜僅襯單層內(nèi)皮細(xì)胞，無(wú)平滑肌細(xì)胞侵入，中膜平滑肌和彈力纖維均較少，缺乏收縮性和彈性，外膜由結(jié)締組織組成（圖1）。兔下腔靜脈球囊損傷后即刻，均可見(jiàn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及部分內(nèi)皮下組織剝脫，部分殘留內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)核異染色質(zhì)邊集 ，中膜部分平滑肌細(xì)胞見(jiàn)線粒體腫脹等改變（圖2）。損傷后7d新生內(nèi)膜形成并增厚，中膜可見(jiàn)梭形平滑肌細(xì)胞排列紊亂（圖3）；30天內(nèi)膜增生明顯，新生內(nèi)膜中可見(jiàn)大量平

15、滑肌細(xì)胞，纖維成分增多，A組新生內(nèi)膜對(duì)比B組明顯減少，內(nèi)膜增生明顯受到抑制（圖4、5）。討 論B-CS的治療已逐步探索出了一系列有效措施，近年來(lái)隨著對(duì)B-CS認(rèn)識(shí)和診斷水平的提高，越來(lái)越多的B-CS病例得到施治，而且治療方法也多種多樣，其中介入治療方法以其操作方法簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小和療效確切等優(yōu)勢(shì)，目前已成為膜性B-CS的首選治療方法4。介入性球囊擴(kuò)張術(shù)治療后影響遠(yuǎn)期效果的主要原因是血管再狹窄或閉塞。球囊擴(kuò)張治療雖然復(fù)通了主肝靜脈或下腔靜脈，達(dá)到了降低門(mén)靜脈或下腔靜脈系統(tǒng)的壓力，但原阻塞部位的病變隔膜仍然存在，且術(shù)中由于血管腔內(nèi)球囊擴(kuò)張撕裂和摩擦，導(dǎo)致不同程度的血管內(nèi)膜損傷，造成內(nèi)皮細(xì)胞缺失，觸發(fā)了

16、平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜增生，從而增加了介入術(shù)后血管再狹窄的概率5。盡管損傷本身也可激發(fā)內(nèi)皮化的發(fā)生，但這種內(nèi)皮化的產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能阻止平滑肌細(xì)胞的激活6。因此，修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞是防治再狹窄的重要方向。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)，循環(huán)中的EPCs可歸巢到血管損傷部位分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)損傷的內(nèi)皮，抑制新生內(nèi)膜的增生，使損傷的內(nèi)皮再內(nèi)皮化7。EPCs和內(nèi)皮細(xì)胞共同參與再內(nèi)皮化過(guò)程，兩者相互影響。G-CSF作為一種血液生長(zhǎng)因子，可以動(dòng)員骨髓EPCs到外周血并遷移到血管內(nèi)膜受損部位，促進(jìn)下腔靜脈球囊損傷模型中血管內(nèi)膜損傷

17、后的再內(nèi)皮化過(guò)程，抑制內(nèi)膜增生8。本研究結(jié)果表明，在對(duì)兔實(shí)施球囊損傷術(shù)術(shù)后7d的標(biāo)本結(jié)果觀察中，G-CSF干預(yù)組和對(duì)照組之間I/M值差異沒(méi)有意義（P0.05），說(shuō)明此期間G-CSF干預(yù)對(duì)受損血管內(nèi)膜的增生沒(méi)有形成有效的抑制。術(shù)后30d標(biāo)本病理切片觀察可見(jiàn)血管內(nèi)膜增生明顯，A組新生內(nèi)膜厚度明顯低于B組， I/M值比較進(jìn)一步證實(shí)G-CSF有效的抑制內(nèi)膜增生，促進(jìn)下腔靜脈球囊損傷后血管再內(nèi)皮化（P0.05）。下腔靜脈內(nèi)膜球囊損傷后再狹窄的機(jī)制十分復(fù)雜，可能激活多種血管活性物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，同時(shí)又有不同的病理發(fā)展時(shí)期，應(yīng)用藥物預(yù)防再狹窄，需要更加詳細(xì)的研究再狹窄的原因以及藥物對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生和發(fā)展的控制，

18、這有待今后進(jìn)一步深入的研究。通過(guò)本研究證明在下腔靜脈內(nèi)膜損傷后修復(fù)過(guò)程中，G-CSF干預(yù)治療有效的促進(jìn)了的再內(nèi)皮化，抑制了內(nèi)膜增生。為臨床上預(yù)防布-加綜合征球囊擴(kuò)張成形術(shù)術(shù)后再狹窄提供一條可探討的途徑。參考文獻(xiàn)1黨曉衛(wèi), 徐大千, 許培欽, 等. 布-加綜合征病因?qū)W研究進(jìn)展. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2010,27:1360-1361.2Jorgensen E, Baldazzi F, Ripa RS, et al. Instent neointimal hyperplasia after percutaneous intervention for ST-elevation myocardial

19、infarction and treatment with granulocyte-colony stimulating factor. Results from the stem cells in myocardial infarction (STEMMI) trial. Int J Cardiol, 2010,139:269-75.3陳開(kāi)，時(shí)德. 國(guó)產(chǎn)Fogarty氣囊導(dǎo)管對(duì)犬下腔靜脈壁損傷的超微結(jié)構(gòu)觀察. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1994:11-14.4Dang XW, Xu PQ, Ma XX, et al. Surgical treatment of Budd-Chiari syndrome: analysis of 221 cases. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2011,10:435-8.5黨曉衛(wèi), 吳陽(yáng), 李捷, 等. 布-加綜合征下腔靜脈病變隔膜相關(guān)基因篩選及其靶基因分布預(yù)測(cè). 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2011,28:1696-1698.6Inoue T, Croce K, Morooka T, et al. Vascular inflammation and repair: