骨髓細胞微核實驗

1、l o g o骨髓細胞微核實驗骨髓細胞微核實驗v 微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒物的快速檢測方法。物的快速檢測方法。v 微核微核(micronucleus,mcn)是指細胞中主核之外的顆粒，染是指細胞中主核之外的顆粒，染色與細胞核一致，相當于細胞直徑的色與細胞核一致，相當于細胞直徑的1/20-1/5，呈圓形或，呈圓形或杏仁狀。是細胞內染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細胞有杏仁狀。是細胞內染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細胞有絲分裂時滯留在細胞核外的遺傳物質。絲分裂時滯留在細胞核外的遺傳物質。實驗原理實驗原理機理：機理：1 1 有絲分

2、裂毒物的作用使個別染色體或帶著絲點的染色體有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶著絲點的染色體環(huán)和斷片在細胞分裂后期被滯留在細胞質中環(huán)和斷片在細胞分裂后期被滯留在細胞質中2 2 斷片或無著絲點染色體在細胞分裂后期不能定向移動，斷片或無著絲點染色體在細胞分裂后期不能定向移動，從而遺留在細胞質中從而遺留在細胞質中結論：結論： 微核試驗能檢測化學或其他物質因素誘導產生的微核試驗能檢測化學或其他物質因素誘導產生的染色體染色體完整性改變完整性改變和和染色體分離改變染色體分離改變這兩種遺傳學終點這兩種遺傳學終點實驗原理實驗原理無核細胞無核細胞紅細胞紅細胞有核細胞中有核細胞中微核難與正常核分葉微核難與正常核分葉

3、及核突出物區(qū)別及核突出物區(qū)別微微核核實實驗驗紅細胞的分化成熟過程紅細胞的分化成熟過程小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的形成小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的形成8環(huán)磷酰胺（環(huán)磷酰胺（ctxctx）v 最常用的烷化劑類抗腫瘤藥。最常用的烷化劑類抗腫瘤藥。v 在體外無抗腫瘤活性，進入體內經轉化、分解，生成酰在體外無抗腫瘤活性，進入體內經轉化、分解，生成酰胺氮芥對腫瘤細胞有細胞毒作用。胺氮芥對腫瘤細胞有細胞毒作用。v 副作用明顯，有惡心、食欲減退、脫發(fā)、白細胞減少、副作用明顯，有惡心、食欲減退、脫發(fā)、白細胞減少、中毒性膀胱炎、肝功能損傷等。中毒性膀胱炎、肝功能損傷等。v 具有顯著的遺傳、生殖毒性：停經或精子缺乏，妊

4、娠初具有顯著的遺傳、生殖毒性：停經或精子缺乏，妊娠初期時給予可致畸胎。期時給予可致畸胎。 v 用藥后用藥后24-3024-30小時，骨髓中微核形成達峰。小時，骨髓中微核形成達峰。9結果結果示小鼠骨髓嗜多染示小鼠骨髓嗜多染紅細胞中一個微核紅細胞中一個微核示小鼠骨髓正常示小鼠骨髓正常嗜多染紅細胞嗜多染紅細胞10示小鼠骨髓嗜多染紅細胞中兩個微核示小鼠骨髓嗜多染紅細胞中兩個微核11示小鼠骨髓嗜多染紅細胞中多個微核示小鼠骨髓嗜多染紅細胞中多個微核giemsagiemsa染色染色v pcepce胞質內含胞質內含有核糖體，染有核糖體，染色呈灰藍色；色呈灰藍色；mcnmcn多數為圓多數為圓形，嗜色性與形，嗜色

5、性與核質一致，呈核質一致，呈紫紅色或藍紫紫紅色或藍紫色色v ncence的核糖體的核糖體已消失，被染已消失，被染成淡桔紅色。成淡桔紅色。nce pce & mcn實驗目的實驗目的1. 用化療藥（環(huán)磷酰胺）制備突變模型用化療藥（環(huán)磷酰胺）制備突變模型2. 觀察小鼠骨髓嗜多染紅細胞（觀察小鼠骨髓嗜多染紅細胞（pce）微）微核核v【animal】 小鼠是微核試驗的常規(guī)動物，通常用小鼠是微核試驗的常規(guī)動物，通常用7 71212周齡，周齡，體重體重181820g20g的小鼠。的小鼠。v【reagents 】 小牛血清小牛血清 giemsa染液染液 環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺實驗動物及試劑實驗動物及試劑實驗分組和染

6、毒方法實驗分組和染毒方法環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺40mg/kg 模型組模型組等體積溶劑等體積溶劑對照組對照組染毒方法（染毒方法（30h兩次給藥法）：兩次給受兩次給藥法）：兩次給受試物間隔試物間隔24h，第二次給藥后，第二次給藥后6h取材取材處死處死：小鼠頸椎脫臼處死；：小鼠頸椎脫臼處死；取股骨取股骨：防止出血；：防止出血；取骨髓取骨髓：小牛血清：小牛血清1滴滴推片推片：30度角；度角；晾干晾干：一定要干；：一定要干；固定固定：甲醇固定：甲醇固定10min, 需要晾干；需要晾干；染色染色：gimesa染液染色（染液染色（1015min）沖洗：沖洗：蒸餾水沖洗，晾干蒸餾水沖洗，晾干閱片閱片: : 觀察微核

7、。觀察微核。 推推 片片 方方 法法觀察與計數：低倍鏡下選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域觀察與計數：低倍鏡下選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域 油鏡下觀察計數油鏡下觀察計數f 多染紅細胞（多染紅細胞（pcepce）呈灰藍色，正染紅細胞（）呈灰藍色，正染紅細胞（ncence）呈）呈橘黃色。典型的微核多為單個、圓形、邊緣光滑整齊，橘黃色。典型的微核多為單個、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色 。f 計數計數10001000個個pcepce中含微核的中含微核的pcepce數，并且計數數，并且計數200200個細個細胞中胞中pcepce與與ncence的比值。的比值。微核率（微核率（）= =含微核含微核pcepce細胞數細胞數pcepce細胞總數細胞總數1000實驗方法和步驟實驗方法和步驟實驗結果實驗結果組別組別動物數動物數受檢受檢pcepce總數總數含微核含微核pcepce數數微核率微核率陰性對照組陰性對照組模型組模型組結果分析與評價v本試驗中只計數本試驗中只計數pcepce中微核，微核率以千分率表示中微核，微核率以千分率表示. .vpce/ncepce/nce為評價細胞毒性的指標：為評價細胞毒性的指標：f正常正常pce/ncepce/nce比值約為比值約為l(l(正常范圍為正常范圍為0.60.61.2)1.2)；f如如pce/nc