關(guān)于P53基因的基因重組及其檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1、關(guān)于P53基因的基因重組及其檢測(cè)實(shí)驗(yàn)摘要：本文主要討論了如何將P53基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后基因與質(zhì)粒進(jìn)行基因重組，然后再采用感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過后，提取質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)好的哺乳細(xì)胞中，再對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功率。關(guān)鍵詞：P53基因；質(zhì)粒；PCR擴(kuò)增；基因重組P53是一種細(xì)胞核磷蛋白，1979年發(fā)現(xiàn)于sv40轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抽提物中,它的質(zhì)量為53kD(千道爾頓),由375個(gè)氮基酸組成,并被證明是由一種細(xì)胞基因所編碼的,故稱該基因?yàn)镻53基因.經(jīng)分析P53,基因定位于17P,基因全長(zhǎng)約2Okb,墓因組有11個(gè)外顯子。P53基因的發(fā)現(xiàn)是癌癥研究上最重要的成就

2、之一。當(dāng)P53,基因完整無損而且功能正常時(shí),它抑制正常細(xì)胞的異常生成,從而防止癌癥的發(fā)生。在人體所有的各種癌癥中,約有半數(shù)與該基因的突變有關(guān).接下來就分點(diǎn)講述對(duì)P53基因所做的實(shí)驗(yàn)。一 P53基因的準(zhǔn)備（1） P53基因的擴(kuò)增基因擴(kuò)增技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction）簡(jiǎn)稱PCR，又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，從而大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力。所以為了提高對(duì)P53基因的分析和檢測(cè)能力，要先進(jìn)行基因的擴(kuò)增，能夠完成基因擴(kuò)增反應(yīng)的儀器就是PCR儀，又稱酶鏈聚合擴(kuò)增儀。（一）試劑（1

3、）引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。 （2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90-100。（3）10PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10PCR緩沖液隨酶一起購(gòu)買。（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300l，-20保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測(cè)定。現(xiàn)用dNTP溶液均有

4、商品化產(chǎn)品。（5）DNA模板：P53基因（二）操作程序過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：（1）向一微量離心管中依次加入DNA模板 102-105拷貝引物 各1mol/LdNTP 各200mol/L10PCR緩沖液1/10體積ddH2O補(bǔ)到終體積（終體積50l-100l）混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25l，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。（2）加石蠟油50-100l于反應(yīng)液表面以防

5、蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97變性10min。（3）冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。（4）PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?4變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72溫育5min，以確保充分延伸。（2） 基因擴(kuò)增后的純化(1)加5倍體積的BufferPB，混勻；(2)將混合液轉(zhuǎn)入QIAquickcolumn，13000rpm離心1min；注1：膠融液轉(zhuǎn)入column后，可先在室溫放置2min；注2：該步需重復(fù)一次。(3)棄去流出液，column放入原管；(4)加

6、0.75mlBufferPE至column，13000rpm離心1min；(5)棄去流出液，column放入原管；(6)第(4)、(5)步重復(fù)一次；(7)13000rpm離心1min，以徹底去除BufferPE；(8)將QIAquickcolumn放入干凈的1.5ml離心管；(9)加30lddH20（向column中心加），放置1min，13000rpm離心1min，離心管中即為割膠回收產(chǎn)物。注：洗脫步可以分兩次，每一次加入20l65預(yù)熱的ddH20，放置2-3min后，13000rpm離心1min。如加入ddH20后4放置過夜亦可增加洗脫效率。（3） 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA瓊脂糖凝膠電泳是

7、用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電池場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速率取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段遷移速率不一樣，可進(jìn)行分離。通過看電泳條帶的分布來檢測(cè)DNA。二 P53基因與質(zhì)粒的重組及其后續(xù)處理（1） P53基因與質(zhì)粒的重組D

8、NA連接就是DNA分子的體外連接在一定條件下, 由dna連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段組鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過程, DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的.本實(shí)驗(yàn)將P53基因與質(zhì)粒進(jìn)行連接，以便將P53基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)試劑：用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNA.如有必要,可用凝膠電泳分離片段并(或)用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒dna.通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml.10T4DNA連接酶buffer(該緩沖液應(yīng)分裝成小份,貯存于-20.)：200mMTris-HCl(pH7.6);50mMMgCl

9、2;50mM二硫芐糖醇;500l/ml BSA(可用可不用)T4DNA連接酶5mM ATP實(shí)驗(yàn)步驟：1、 在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10l體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子(一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為11-15),補(bǔ)足ddH2O 至8l.2) 輕輕混勻,稍加離心,于45水浴5分鐘使重新退火的粘端解鏈, 迅速將混合物轉(zhuǎn)入冰浴.3) 加入含ATP的10Buffer 1l,T4 DNA連接酶合適單位, 用ddH2O 補(bǔ)至10l.2、 蓋上管蓋,充分混勻,臺(tái)式離心扣上離心5秒.3、 12下過夜連接反應(yīng).4、 反應(yīng)結(jié)束后于-2

10、0保存.5、 再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng),其中含有(1)只有質(zhì)粒載體;(2)只有外源DNA片段.如果外源DNA量不足,每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒DNA,并盡可能多加外源DNA,同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過10l.可用至少3種不同方法來測(cè)定T4噬菌體DNA連接酶的活性.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化通過感受態(tài)細(xì)胞法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備儀器所用儀器有超凈工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫箱、恒溫水浴器、制冰機(jī)等。器皿所用器皿有移液槍（2.5ul、10ul、1000ul）、槍頭盒（藍(lán)、黃）、槍頭（藍(lán)、黃）、培養(yǎng)皿、1.5ml離心管、泡沫塑料盒、帶帽試管、250ml錐形瓶、酒精燈、浮子等。2.2.

11、3試劑所用試劑有0.1mol/LCaCl2溶液，購(gòu)買的感受態(tài)細(xì)胞，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（Amp），X-gal，IPTG等。2.3實(shí)驗(yàn)方法從大腸桿菌DH5平板上挑取一個(gè)單菌落接于50mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜（16小時(shí)）。分別取2.0ml菌液轉(zhuǎn)接到三個(gè)含有100mlLB液體培養(yǎng)基錐形瓶中,37振蕩培養(yǎng)2-3h。(此時(shí),OD600=0.5,細(xì)胞數(shù)務(wù)必108/ml,此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)。將菌液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,冰上放置30min。在低溫離心機(jī)中于4離心10min(4000rpm),回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。用冰冷的0.1mo

12、l/LCaCl2700l懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。44000rpm，離心10min，回收細(xì)胞。用冰冷的0.1mol/LCaCl2300l懸浮細(xì)胞（務(wù)必放冰上）。取200l新鮮配制的感受態(tài)細(xì)胞和20l已購(gòu)買的感受態(tài)細(xì)胞，分別加入DNA2l（50ng）混勻，冰上放置30min。將管放到42恒溫水浴1-2min（約90秒）。冰浴2min。每管加800lLB液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床于37培養(yǎng)1h(慢搖)。100ml的瓊脂培養(yǎng)基中，滅菌后冷卻到60度左右，加入100l的IPTG溶液、200l的X-Gal和100l的Amp，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)

13、細(xì)胞，涂在含有X-gal、IPTG及氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。倒置平皿37培養(yǎng)12-16h，則出現(xiàn)菌落，觀察并記錄結(jié)果。質(zhì)粒的提取及其檢測(cè)質(zhì)粒的提取3.儀器設(shè)備:臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱等。Eppendorf離心管，Tip頭，三角瓶等滅菌備用。電泳儀，電泳槽，樣品梳，微波爐，水浴鍋，移液器（20ul,200ul和1000ul），離心管，Tips(200ul,1000ul)。四操作步驟：1.質(zhì)粒提取（1）將2ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml的試管中，接種一單菌落，用棉塞封口，在37劇烈震蕩（250rpm）培養(yǎng)過夜。（2）將1.5ml培養(yǎng)物

14、轉(zhuǎn)入離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)在4條件下離心30秒（12,000g）。（3）棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀物懸浮于200mlSTET緩沖液，用渦旋混合器充分混勻。（4）加入4ml新鮮配制的溶菌酶液，混勻，置室溫下5min。（5）用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時(shí)45秒，取出后立刻離心10min。（6）用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入8ml5%CTAB，用混合器混勻后，高速離心5min，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體。（7）加入1.2M氯化鈉300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的冷乙醇，充分混勻后，離心15min，棄上清液。（8）取1m

15、l70%冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，離心5min。棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥5-10min。（9）沉淀物溶于50mlTE緩沖液中，混合器混勻。（10）即成質(zhì)粒制備液，制備的質(zhì)粒供下一步實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)粒的檢測(cè)3.質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳1)量取100毫升TAE電泳液，加入0.7克瓊脂糖，混勻后，置于微波爐中，加熱3分鐘，充分溶解瓊脂糖。注意觀察，當(dāng)心煮沸的液體，溢出！2)用滅菌后的橡皮膠，封閉清潔干燥的電泳板，并用少量的瓊脂糖液封邊。安放梳子，調(diào)整梳子的底部邊緣與電泳板之間的距離，一般以1-2毫米為宜。3)當(dāng)溶解后的瓊脂糖液冷卻至500C左右時(shí)，加入溴化乙錠5ml，溴

16、化乙錠的最終濃度為1.0mg/ml.混勻后，將瓊脂糖液倒入電泳板中，靜止，切勿移動(dòng)。4)在凝膠完全凝固后（于室溫放置30-45分鐘），輕輕地取出梳子，除去膠帶，將凝膠放入電泳漕中。5)電泳漕中，加入電泳液（1TAE），使電泳液覆蓋在瓊脂糖膠面之上約1-2毫米。6)取上一實(shí)驗(yàn)制備的質(zhì)粒提取液（酶切），加入1/5樣品緩沖液，充分混勻。用移液器將樣品小心地加入點(diǎn)樣孔。在不同的點(diǎn)樣孔中，分別加入DNA分子量標(biāo)記物（marker），對(duì)照以及質(zhì)粒提取液（酶切）樣品7)接通電源，在90V下，電泳1小時(shí)，當(dāng)溴酚蘭顏料遷移至凝膠前沿時(shí)，切斷電源。8)取出凝膠，在紫外燈下，觀察DNA的遷移位置，并討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。細(xì)

17、胞的選擇（1） HEK-293細(xì)胞系：正常腎細(xì)胞（2） HEK-293A/T/FT等，是基于293細(xì)胞進(jìn)行的一系列改造。各個(gè)細(xì)胞株的特點(diǎn)有所區(qū)別。（3） HEK-293T：生長(zhǎng)速度快，經(jīng)SV40感染，尤其適用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞的活化與培養(yǎng)（1） 細(xì)胞保存：細(xì)胞懸液+DMSO，液氮凍存，可保存幾十年。-80度保存，可保存幾個(gè)月。（2） 細(xì)胞活化：將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速置于42度水浴鍋中融化，融化后，將凍存液轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，加入2-3ml培養(yǎng)基（DMEM），混勻后，于1000rpm離心5分鐘(此步動(dòng)作要迅速，減少DMSO對(duì)細(xì)胞的傷害)。去掉上淸液（可吸掉或直接倒掉），加入2ml培養(yǎng)

18、基，輕輕吹打重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加入700微升培養(yǎng)基和300微升血清。于37度，CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的培養(yǎng)與換液（1） 從冰箱中取出培養(yǎng)基DMEM和血清，放入超凈臺(tái)。打開超凈臺(tái)紫外30分鐘，開燈開風(fēng)機(jī)。（2） 用酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面及槍盒、槍等器具。（所有外面進(jìn)入超凈臺(tái)的物品均需要噴灑酒精方可進(jìn)入）。（3） 從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放在超凈臺(tái)上觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。若細(xì)胞良好，無污染，即可放入超凈臺(tái)中準(zhǔn)備換液?；蚣?xì)胞生長(zhǎng)過滿，則需要傳代分瓶。（4） 用干凈槍頭將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基全部吸掉（注意不要將槍頭戳到培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞上），加入2mlPBS溶液，輕輕地水平晃動(dòng)，以洗滌細(xì)胞。（5） 將培養(yǎng)瓶立起來后吸去PBS洗液，重復(fù)PBS洗滌一遍并吸去洗液。（6） 加入培養(yǎng)基DMEM4.5ml和0.5ml血清（血清量10%），放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染鋪板（1） 轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，并將細(xì)胞吹散，分散成為單個(gè)細(xì)胞，按1*106數(shù)量級(jí)接種到6孔板中。注意：此步驟所用培養(yǎng)基為含血清無抗的O