蠶豆病的設計性實驗

1、2012年設計性實驗年設計性實驗組員：吳怡蓉、付世錦、 楊有穩(wěn)、梁燕 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。 體格檢查：體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmhg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實驗室檢查：紅細胞 1.981012/l，血紅蛋白53g/l，血清總膽紅素85.5mol/l，結(jié)合膽紅素13.7mol/l，未結(jié)合膽紅素71.8mol/l，尿蛋白

2、（+），潛血(+)，尿膽紅素()，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細胞。 理論依據(jù)理論依據(jù) 溶血性黃疸 ：由于紅細胞的大量破壞，使膽紅素產(chǎn)生過多，超過了肝細胞攝取結(jié)合的能力，使得尿中尿膽原和尿膽素含量增多。葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏，輸血不當均會引起病癥 蠶豆?。浩咸?6-磷酸脫氫酶缺乏?；颊叽蠖嘣谑秤眯Q豆后發(fā)生急性溶血性貧血。典型病人常出現(xiàn)由于大量紅細胞破壞釋放出膽紅素二導致的溶血性黃疸 ，惡心嘔吐，尿液呈醬油樣等癥狀 誘因：一天前食用蠶豆 既往史：姐姐也曾出現(xiàn)過此癥狀蠶豆病發(fā)病機制 食用蠶豆 產(chǎn)生大量過氧化氫，不被清除 紅細胞膜脂質(zhì)被氧化破壞 急性血管內(nèi)溶血，產(chǎn)生過多膽紅素 導致溶血性黃疸，惡

3、心，嘔吐，尿液呈醬油樣 6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏使磷酸戊糖途徑受阻。nadph+h+缺乏致血還原型谷胱甘肽生成不足。 紅細胞被破壞，則可被肝等單核吞噬細胞識別并吞噬，釋放血紅蛋白，進一步分解為珠蛋白和血紅素，而血紅素被吞噬細胞降解為膽紅素。 膽紅素是人體內(nèi)原型抗氧化劑，能夠清楚超氧化劑和過氧化物自由基，因患兒體內(nèi)有大量過氧化氫，氧化應激可誘導ho-1的表達，從而增加膽紅素的量升高來抵御氧化應激狀態(tài)?；純赫＃▋和┘t細胞1.981012/l 4.010125.310 12/l血紅蛋白53g/l 120-140g/l 血清總膽紅素85.5mol/l 1.7117.1mol/l 結(jié)合膽紅素13.7

4、mol/l 03.42mol/l 未結(jié)合膽紅素71.8mol/l 013.68mol/l 尿蛋白(+)潛血(+)尿膽紅素() 尿膽素原(+)從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果 主要臨床表現(xiàn)：1. 血尿、排醬油色尿、面 色蒼白 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 體溫升高 4. 呼吸急促1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白g6pdgsh的主要作用：的主要作用： 保護紅細胞內(nèi)的含硫氫基保護紅細胞內(nèi)的含硫氫基 （-sh）血紅蛋白、酶蛋白和膜）血紅蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化蛋白的完整性，免遭氧化 與谷胱甘肽過氧化酶共同使與谷胱甘肽過氧化酶共同使 h2o2還原成還原成h2onadph+h+紅

5、細胞的抗氧化能力紅細胞的抗氧化能力gsh紅細胞紅細胞 膜破裂膜破裂溶血性貧血溶血性貧血（面色蒼白）（面色蒼白）游離游離hb腎腎 吸收閾值吸收閾值血紅蛋白尿/ 含鐵血黃素尿2. 皮膚及鞏膜黃染3. 體溫升高機理： 紅細胞破裂 血紅蛋白暴露 免疫系統(tǒng)攻擊（單核-吞噬細胞系統(tǒng)） 體溫升高4. 呼吸急促溶血性貧血 具有載o2能力的hb含量下降機體缺o2呼吸急促實驗設計高鐵血紅蛋白還原法實驗思路 患者姐姐出現(xiàn)過此類狀況推患者姐姐出現(xiàn)過此類狀況推測屬于家族性遺傳，且患者測屬于家族性遺傳，且患者在食用蠶豆后出現(xiàn)癥狀，故在食用蠶豆后出現(xiàn)癥狀，故即有可能為蠶豆病。即有可能為蠶豆病。6-磷酸磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏影

6、響高鐵葡萄糖脫氫酶缺乏影響高鐵血紅蛋白的還原，故可以依血紅蛋白的還原，故可以依據(jù)如下反應機制設計實驗。據(jù)如下反應機制設計實驗。亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白還原酶 nadph(輔酶輔酶) 亞甲藍亞甲藍(遞氫體遞氫體)亞硝酸鈉亞硝酸鈉實驗反應方向 一、實驗目的 1、檢測患者體內(nèi)6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性以及發(fā)病原因 2、掌握高鐵血紅蛋白還原法測6-磷酸葡萄糖脫氫酶的實驗原理及方法 3、了解蠶豆病的發(fā)病機制及原因 二、實驗原理二、實驗原理 在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（mhb）,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作

7、用下又被還原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍作為遞氫體，還需要由g6pd參與磷酸戊糖途徑形成nadph作為輔酶才完成上述反應。所以，g6pd缺陷癥的患者其mhb還原率下降（分光光度技術(shù)）。 三、實驗器材及試劑 器材：離心機、分光光度計、微量移液器 水浴箱、1.5mlep管、抗凝管，試管 試劑： 0.18mol/l亞硝酸鈉-葡萄糖溶液、 0.4mmol/l亞甲藍溶液 、 0. 28 mol/ l 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）、生理鹽水、抗凝劑、患者靜脈血、 蒸餾水 四、實驗步驟 1、取靜脈血1. 8ml 于抗凝管(含0. 2 ml109 mmol/ l抗凝劑+葡萄糖

8、20 mg），混勻 2、離心沉淀 1000 r/ min 15 min 3、調(diào)整 血細胞 血漿=1 1 ，混勻 ，（調(diào)整后全血） 4、1ml 0. 18 mol/ l 亞硝酸鈉、1ml 0. 28 mol/ l 葡萄糖溶液 、0.14 mmol/ l 亞甲基藍液，混勻 ，得到混合試劑混合試劑1ml 5、取試管3 支,標上a、b、s ,按下表加入試劑高鐵血紅蛋白還原試驗操作步驟混合試劑/ ml 0. 01 / /生理鹽水/ ml / 0. 01 /0. 18 mol/ l 亞硝酸鈉- / / 0. 010. 28 mol/ l葡萄糖溶液/ ml 經(jīng)調(diào)整的全血/ ml 0. 1 0. 1 0. 1

9、來回搖動1520 次,置37 水浴箱靜置3 h蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 試劑 a b sb管為空白管, 在波長635 nm處，測定“a”管及“s”管吸光度 六、實驗結(jié)果 實驗結(jié)果計算：計算高鐵血紅蛋白還原率公式：mhb % = (1 - a/ s) 100 % 計算出其還原率與正常值比較 七、實驗分析 該患者可能患有先天性鐮刀貧血癥或蠶豆病。 正常的高鐵血紅蛋白還原率75%，若計算所得還原率低于75%，且患者姐姐也有類似癥狀，患者吃過蠶豆后發(fā)病，故可推斷患者患有蠶豆病 八、注意事項1、血細胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白還原率降低。應將血細胞比容調(diào)整到0.35-0.402、細菌污