重組DNA技術(shù)精簡版

1、 基因重組與基因工程基因重組與基因工程 gene recombination and genetic engineering 孫慶濤 劉華明2011.3.16 重組重組dna技術(shù)又稱為基因工程（技術(shù)又稱為基因工程（genetic engineering）或分子克隆或分子克?。╩olecular cloning）?；蚬こ痰牟僮鬟^程主要由以下步驟組成：基因工程的操作過程主要由以下步驟組成：載體和目的基因的分離載體和目的基因的分離載體和目的基因的切斷載體和目的基因的切斷載體和目的基因的重組載體和目的基因的重組重組重組dna的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增重組重組dna的篩選和鑒定的篩選和鑒定 一、載體和目

2、的基因的分離一、載體和目的基因的分離 為了進(jìn)行基因重組，首先需要對(duì)載體為了進(jìn)行基因重組，首先需要對(duì)載體dna和目的和目的基因分別進(jìn)行分離純化，得到其純品?；蚍謩e進(jìn)行分離純化，得到其純品。（一）載體：（一）載體：基因工程中常用的載體基因工程中常用的載體(vector)主要包括主要包括質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)噬菌體噬菌體(phage)病毒病毒(virus) 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。一的限制酶切點(diǎn)等。 1質(zhì)粒：質(zhì)粒： 存在于天然

3、細(xì)菌體內(nèi)的一種存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)雙鏈環(huán)狀狀dna，具有，具有獨(dú)立復(fù)制獨(dú)立復(fù)制的能力，的能力，通常帶有細(xì)菌的通常帶有細(xì)菌的抗藥基因抗藥基因。最早使用的質(zhì)粒最早使用的質(zhì)粒dna是人工構(gòu)建是人工構(gòu)建的的pbr322，該質(zhì)粒分子大小為，該質(zhì)粒分子大小為4.3kb，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素基因，含霉素基因，含ecor，bamh，hind等單一的限制酶切點(diǎn)。等單一的限制酶切點(diǎn)。 2噬菌體：噬菌體： 可 通 過 轉(zhuǎn) 染 方 式 將 其可 通 過 轉(zhuǎn) 染 方 式 將 其dna送入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖。送入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖。常用的為人

4、工構(gòu)建的常用的為人工構(gòu)建的噬菌噬菌體載體體載體。噬菌體兩端的片段。噬菌體兩端的片段對(duì)于其包裝是必需的，因而對(duì)于其包裝是必需的，因而應(yīng)予保留；而其中間部分則應(yīng)予保留；而其中間部分則可進(jìn)行改造或置換，使之具可進(jìn)行改造或置換，使之具有某種單一的限制酶切點(diǎn)。有某種單一的限制酶切點(diǎn)。目的基因與噬菌體目的基因與噬菌體dna進(jìn)行進(jìn)行重組時(shí)，可采用重組時(shí)，可采用插入重組方插入重組方式式，也可采用，也可采用置換重組方式置換重組方式。 3病毒：病毒： 常用的為常用的為sv40，通過感染方式將其，通過感染方式將其dna送入哺乳送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。（二）目的基因：（二）目的基因：目的基因的

5、篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行：目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行：1直接從染色體直接從染色體dna中分離：中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。2人工合成：人工合成： 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。多肽的基因。 3.從從mrna合成合成cdna： 采用一定的方法釣取采用一定的方法釣取特定基因的特定基因的mrna，再通，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)補(bǔ)dna（cdna

6、），），除去除去rna鏈后，再用鏈后，再用dna聚合聚合酶合成其互補(bǔ)酶合成其互補(bǔ)dna鏈，從鏈，從而得到雙鏈而得到雙鏈dna。這一方。這一方法通?？傻玫娇杀磉_(dá)的完法通?？傻玫娇杀磉_(dá)的完整基因。整基因。 4從基因文庫中篩選：從基因文庫中篩選： 將某一種基因?qū)⒛骋环N基因dna用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體dna重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組dna的種群，稱為的種群，稱為g-文庫文庫(genomic dna library)。 將某種細(xì)胞的全部將某種細(xì)胞的全部mrna通過逆轉(zhuǎn)合成通過逆轉(zhuǎn)合成cdna，然，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

7、，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為c-文庫文庫(cdna library)。c-文庫具有組織細(xì)胞特異性。文庫具有組織細(xì)胞特異性。 5利用利用pcr合成：合成： 如已知目的基因兩端如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,pcr）技術(shù)，在）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。基因堿基序列的改變。 pcr概述概述 pcr：使用一對(duì)寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用：使用一對(duì)寡核苷酸引物，

8、以目的序列為模板，利用dna合成合成 酶和四種脫氧酶和四種脫氧核糖核酸進(jìn)行核糖核酸進(jìn)行dna的體外合成反應(yīng)。的體外合成反應(yīng)。 pcr技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個(gè)小時(shí)技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。 該技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)該技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)80年代中期由美國年代中期由美國k.mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，k.mullis也因此獲得也因此獲得1993年

9、度的諾貝爾化學(xué)年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。獎(jiǎng)。 pcr基本原理基本原理 dna在細(xì)胞中的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是在細(xì)胞中的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是 dna聚合聚合酶、酶、dna連接酶、引發(fā)酶、連接酶、引發(fā)酶、dna引物、四種脫氧核糖核酸、引物、四種脫氧核糖核酸、dna超螺旋酶、離子環(huán)超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。境等多成份參與的過程。 pcr是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的dna復(fù)制，所以在一個(gè)復(fù)制，所以在一個(gè)pcr中必需成分是中必需成分是 1. 模板模板dna 2. dna聚合酶聚合酶 3. 四種脫氧核糖

10、核酸四種脫氧核糖核酸 4. 正向和反向兩條引物正向和反向兩條引物 5. 適當(dāng)?shù)木彌_體系。適當(dāng)?shù)木彌_體系。1.變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版dna成為單鏈的成為單鏈的dna分子；在應(yīng)用分子；在應(yīng)用taq dna聚聚合酶進(jìn)行合酶進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)，變性往往在反應(yīng)時(shí)，變性往往在9495條件下進(jìn)行。這也是條件下進(jìn)行。這也是taq dna聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行30個(gè)左右的個(gè)左右的pcr循環(huán)而活力不致受到過多損失時(shí)所能耐受的最適溫度。循環(huán)而活力不致受到過多損失時(shí)所能耐受的最適溫度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物退火：是指引

11、物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低的熔解溫度低510，pcr實(shí)驗(yàn)要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。pcr基本步驟基本步驟3.延伸：在鎂離子存在條件下，延伸：在鎂離子存在條件下，dna聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成與模版方向生成與模版dna互補(bǔ)的新互補(bǔ)的新dna鏈。鏈。雙鏈模版雙鏈模版dnadna變性變性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物

12、下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循環(huán)多次循環(huán)（2 2n n 拷貝）拷貝）1、目的基因的克隆、目的基因的克隆2、基因的體外突變、基因的體外突變3、dna和和rna的微量分析的微量分析4、dna序列測定序列測定5、基因突變分析、基因突變分析pcr的主要用途的主要用途二、載體和目的基因的切斷二、載體和目的基因的切斷 通常采用通常采用限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對(duì)載體，簡稱限制酶，分別對(duì)載體dna和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。 限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)限制酶目前已經(jīng)

13、發(fā)現(xiàn)400多種，所識(shí)別的順多種，所識(shí)別的順序往往為序往往為4-8個(gè)堿基對(duì)，且有個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)。 由限制酶切斷后的末端可形成由限制酶切斷后的末端可形成平端、平端、3-突突出粘性末端和出粘性末端和5-突出粘性末端突出粘性末端三種情況。形成三種情況。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者較有利于載體者較有利于載體dna和和目的基因的重組。目的基因的重組。 三、載體和目的基因的重組三、載體和目的基因的重組 即將帶有切口的載體與所獲得即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新的目的基因連接起來，得到重新組合后的組合后的dna分子。分子。（一）粘性末端連接法：（一）

14、粘性末端連接法： 當(dāng)載體當(dāng)載體dna和目的基因均和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入行互補(bǔ)粘合，再加入dna連接連接酶，即可封閉其缺口，得到重酶，即可封閉其缺口，得到重組體。組體。 較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。端也可直接進(jìn)行連接。 （二）人工接尾法：（二）人工接尾法： 即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采

15、用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。時(shí)，可采用此方法。 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的載體或目的基因的3-端，如載體上添加一段端，如載體上添加一段polyg，則可在目的基因上添加一段則可在目的基因上添加一段polyc，故二者即可通過堿，故二者即可通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由dna連接酶連接。連接酶連接。 （三）人工接頭連接法：（三）人工接頭

16、連接法： 將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的dna片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。互補(bǔ)的粘性末端。 四、重組四、重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化（transformation） 轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或其他外源轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠磀na導(dǎo)入處于感受態(tài)的導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸

17、桿菌。大腸桿菌懸浮在主細(xì)胞是大腸桿菌。大腸桿菌懸浮在cacl2溶液中，并溶液中，并置于低溫（置于低溫（05）環(huán)境下一段時(shí)間，鈣離子使細(xì)胞膜）環(huán)境下一段時(shí)間，鈣離子使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，從而具有攝取外源的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，從而具有攝取外源dna的能力，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（的能力，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）。）。 (二二)感染（感染（infection） 噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組dna分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感

18、染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖。噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖。由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程也稱為由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。）。 (三三)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（transfection） 轉(zhuǎn)染是指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源轉(zhuǎn)染是指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源dna片段片段而獲得新的表型的過程。而獲得新的表型的過程。 常用的方法有電穿孔法（常用的方法有電穿孔法（electroporation）、磷酸鈣）、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體融合法等。進(jìn)入細(xì)胞的沉淀法、脂質(zhì)體融合法等。進(jìn)入細(xì)胞的dna可以被整合至可以被整合至宿主細(xì)胞的

19、基因組中，也可以在染色體外存在和表達(dá)。宿主細(xì)胞的基因組中，也可以在染色體外存在和表達(dá)。 五、重組五、重組dna的篩選和鑒定的篩選和鑒定 由于重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的比例通常較低，由于重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的比例通常較低，因此需要對(duì)含有重組體的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作因此需要對(duì)含有重組體的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作鑒定。可采用以下方法進(jìn)行：鑒定。可采用以下方法進(jìn)行：（一）根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選：（一）根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選： 對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插插入滅活法入滅活法進(jìn)行篩選。如進(jìn)行篩選。如pbr322中帶有抗氨芐青中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在