高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌分離篩選及多樣性分析

1、高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選及多樣性分析-農(nóng)學(xué)論文高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選及多樣性分析胡 甜1,江林峰1,陳青云1,余知和1,毛 濤2，李 利1(1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州4 3 4 0 2 5; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢4 3 0 2 2 3 )摘要：采用生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)的富集培養(yǎng)法，從生活污水排放渠中分離篩選出高 效異養(yǎng)硝化細(xì)菌，并對(duì)其多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，從分離得到的27株異 養(yǎng)硝化細(xì)菌中篩選出6株高效菌株Ni 12、 Ni1 8、Ni2 5、Ni 2 7、Ni3 1和N i34，其48h氨氮去除率分別為88.9%、7 6.6%、87.

2、7%、93.1%、99.2% 和 9 1.4% ;結(jié)合菌落形 態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、掃描電鏡觀察和16SrDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株的種類較為豐富，初步確定Ni12和Ni18為節(jié)桿菌屬 (Arthrob acter) ， Ni2 5 和 N i3 1為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligene s)，Ni2 7 為無(wú)色桿菌屬 (Achromobacter) ， Ni34 為 芽抱桿菌屬(Bacillus)。該結(jié)果可為高效異養(yǎng)硝化菌的分離篩選及其 多樣性分析提供參考。關(guān)鍵詞：異養(yǎng)硝化；節(jié)桿菌屬(Arthrobacter);產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes) ;無(wú)色桿菌屬(Achromobacter) ;

3、芽 抱桿菌屬(Bacillus)中圖分類號(hào)：X 7 0 3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)：0439 8 114 ( 2 0 15 )05 1181-05DOI : 10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.039收稿日期：2014 10 09基金項(xiàng)目：湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013ECE009) ;湖北省高 校青年教師深入企業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(XD2014068) ;濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利 用教育部工程研究中心開(kāi)放基金項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介：胡 甜(1 9 9 3 )，女，湖北仙桃人，在讀本科生，(電話)1 5 1 7 1 1 3 4 2 0 9 (電子信箱)2466475678;通信作者，

4、李 禾0( 1 9 8 3 )，講師，主要從事食品微生物和環(huán)境微生物教學(xué)和研究，(電話)0 7 1 6 8 0 66 7 12(電子信箱)1 ily2012。隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和人民生活水平的提高，未經(jīng)適當(dāng)處理的含氮廢水，如生活污水、工業(yè)、種植業(yè)及禽畜養(yǎng)殖業(yè)廢水等，大量排放入江河湖泊，造成了 越來(lái)越嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，危害到農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、旅游業(yè)等諸多行業(yè)，對(duì)飲 水衛(wèi)生和食品安全也構(gòu)成了巨大威脅。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在脫氮微生物菌株的篩選 和培育研究方面非常活躍，一些異養(yǎng)硝化菌、好氧反硝化菌、自養(yǎng)反硝化菌、厭 氧氨氧化菌等非傳統(tǒng)脫氮微生物不斷被發(fā)現(xiàn)1 -4，為研究開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的 氮污染物凈化技術(shù)

5、提供了新的理論和思路。異養(yǎng)硝化菌是指在好氧條件下能將氨氮或還原態(tài)有機(jī)態(tài)氮氧化成羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的一類微生物5。異養(yǎng)硝化微生物的發(fā)現(xiàn)，是對(duì)傳統(tǒng)硝化理論 的豐富與突破，特別是一些異養(yǎng)硝化微生物同時(shí)具有好氧反硝化的特性，可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化的全新脫氮工藝6。因此，異養(yǎng)硝化微生物的重要性日益受 到關(guān)注7 10。異養(yǎng)硝化微生物種類繁多，分布于藻類、放線菌、真菌和細(xì)菌中7。由于其遺傳背景的差異性，不同的異養(yǎng)硝化微生物的生長(zhǎng)及硝化特點(diǎn)都有所不同60并且異養(yǎng)硝化菌可以利用的基質(zhì)范圍廣泛，如銨、胺、酰胺、N-烷基 羥胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，這使得異養(yǎng)硝化機(jī)理到目前仍不清楚， 其代謝途徑也未被確定

6、和證實(shí)11。從自然環(huán)境中分離不同的異養(yǎng)硝化菌， 對(duì)研究異養(yǎng)硝化途徑和異養(yǎng)硝化微生物多樣性，以及開(kāi)發(fā)新型高效脫氮工藝具有 重要意義。為此，本研究通過(guò)四級(jí)富集培養(yǎng)法從生活污水排放渠中分離篩選高效 異養(yǎng)硝化細(xì)菌，分析其多樣性，為異養(yǎng)硝化菌的理論研究和應(yīng)用研究提供材料。1 材料和方法1.1 環(huán)境樣品采集排污溝渠距水面10 cm處的水樣以及其附近10 cm深度的土樣。 采樣后立即用于異養(yǎng)硝化細(xì)菌的篩選。19 嚴(yán)并甘1.Z 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基(pH 7.0):C6H5O7Na35.00 g，(NH4)2SO4 1.24 g，KH2PO4 1.00 g，Na2HPO4 7.8 5 g，NaCl 0.50 g,

7、MgSO4 0.0 5 g,微量元素溶液1 21 mL，補(bǔ)充去離子水至1 L。用于異養(yǎng)硝化菌的富集培養(yǎng)。異養(yǎng)硝化培 養(yǎng)基 (pH 7.0):C6H5O7Na37.5 0 g，(NH4)2SO 40.6 6 g,Na2HPO4 3.7 g，其余成分同富集培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂。用于異養(yǎng)硝化菌的分離純化及氨氮去除能力研究。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(pH 7.2):牛肉膏5 g,蛋白胨10 g，N aCl 5 g,補(bǔ)充去離子水至1 L。固體培養(yǎng)基添加1 .5%的瓊脂。用于 菌株的形態(tài)觀察、保存及活化。1.3 異養(yǎng)硝化菌的篩選1.3.1 富集培養(yǎng) 取土樣10 g或水樣10 mL加入到9 0 m

8、L含有玻璃珠的無(wú)菌水中，震搖3 0 min使樣品充分分散。取上清5 mL接種 到9 5 mL富集培養(yǎng)基中，于30 C,160 r/mi n搖床震蕩培養(yǎng)，每 隔2 h測(cè)定富集液的0D 6 0 0nm繪制生長(zhǎng)曲線，在穩(wěn)定期初期轉(zhuǎn)接2 0mL培養(yǎng)液至8 0 mL新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次。富集期 間定期檢測(cè)培養(yǎng)液中氨氮含量，若氨氮顯著減少，表示富集液中含有硝化微生物， 可用于后續(xù)分離純化試驗(yàn)。1.3.2 分離純化取富集培養(yǎng)液作梯度稀釋，涂布固體異養(yǎng)硝化培養(yǎng) 基平板，30 C培養(yǎng)3 d,挑取不同形態(tài)的菌落接種到液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，3 0 C震蕩培養(yǎng)3 6 h，檢測(cè)培養(yǎng)液中氨氮的含量，將

9、氨氮去除率較高的培養(yǎng) 液再次稀釋涂布平板進(jìn)行分離和篩選，直到得到氨氮去除效果較好的純培養(yǎng)菌 株。1.4 菌株的多樣性分析1.4.1 形態(tài)觀察 將分離得到的菌株涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 C 培養(yǎng)2 d，觀察菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)以及掃描電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。1.4.2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA作為模板，采用通用引物13 27F(5AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3)和 1492R(5TACCTT GTT ACG ACT T3)進(jìn) 行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50L) : 1

10、0X PfBuffer 5 yL, 2.5 mmol/L dNTP 2L,10 ymo1/L引物各2.0 yL, 基因組DNA 50 ng,P fu DNA聚合酶 2 U, FddH2O 至5 0 yLPCR 反應(yīng)條件：94C5min;94C 3 0s,55 C 30s,72C 2 min,28 個(gè)循環(huán)；72 C 8 min0PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。測(cè) 序所獲序列在NCEI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載部分相似性高的序列及一些常見(jiàn)的異養(yǎng)硝化細(xì)菌和自養(yǎng)硝化細(xì)菌的16SrDNA序列，利用MEGA 5. 1軟件中基于Kimura 2parameter模

11、型的 Neighbour joining (NJ)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)14。1.5 氨態(tài)氮(N H4+ N)的檢測(cè)定性檢測(cè)：取6 0 0 yL待測(cè)樣品于比色板上，滴加50yL鈉氏試劑，呈黃色，則培養(yǎng)液中含氨氮，顏色越深，氨氮含量越高。定量檢測(cè)：采用國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)氨氮的測(cè)定一鈉氏試劑分光光度法(HJ 535 2009)。2 結(jié)果與分析2.1 菌株的分離純化通過(guò)生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)的四級(jí)富集培養(yǎng)得到氨氮?dú)埩袅枯^少的培養(yǎng)液，對(duì)稀釋后 的培養(yǎng)液進(jìn)行涂布平板分離和連續(xù)多次劃線純化， 成功獲得具有異養(yǎng)硝化能力的 異養(yǎng)型菌株共2 7株，分別編號(hào)為Ni1 1Ni1 13,Ni2 1 Ni2 9,Ni3 1Ni3

12、 5o2.2 菌株的篩選將分離純化后的菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,各取600 yL培養(yǎng)液于白色的比色板上，用定性檢測(cè)方法檢測(cè)氨氮的去除情況， 結(jié)果見(jiàn)表1。由表 1可知，菌株Ni 12、Ni1 8、Ni2 5、Ni2 7、Ni3 1、 N13-4培養(yǎng)液用納氏試劑顯色后顏色較淺，表明培養(yǎng)液中氨氮?dú)埩袅枯^少， 這6株菌株的異養(yǎng)硝化能力較強(qiáng)。 |異葬和乞創(chuàng)璨的第氐試刑色反即*： th = yNil-i帕弋Nd-2*Ki2-7+Ml-3+-4+Ml-VZ+2.3 菌株的氨氮去除率將篩選得到的6株異養(yǎng)硝化能力較強(qiáng)的菌株接種于液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，3 0 C 6 0 r/mi n搖床培養(yǎng)4 8 h,檢測(cè)

13、氨氮濃度的變化， 結(jié)果顯 示6株菌株的氨氮去除效果較好（表2）,氨氮去除率為7 6.6%99. 2%。闈株舉勺術(shù)I-2MJil-S76.62-5B7.7NS2-7町WJ2NLJ-49L42.4 菌株的多樣性分析2.4.1 形態(tài)學(xué)分析 將活化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中30C培養(yǎng)2 d后，分別觀察其菌落形態(tài)、菌體細(xì)胞形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)。結(jié)果顯示，6株菌株在菌落大小、顏色、形狀、邊緣、表面光澤、透明程度、以及菌體，呈現(xiàn)出較好的多樣性。細(xì)胞大小和形態(tài)方面的差異明顯（表3,圖1和圖2）A3召廉耳莽確憂欖力較彈揀前崔態(tài)特誼掙M血片用齊誚吒歯料的薦乂也否年潘拮詩(shī)補(bǔ)耶蘭民冬芭僧佯犧犧幣土NB眉鼠曲瓶&K

14、AJK.占也洋.4、進(jìn)畸、禮此色fefUt*凸亂邊軌觀i光m.右電斯，這瞄、壬門叵fam珀稈強(qiáng)NU-5劍珂，壯虻.匕集簽序.理壬芝!_0屯潭半芳叫，豊邑艸ffttNU-?期劈*芒程一曲榮嚳卄.世筒吃淆 梧無(wú)汎t豈臥乳臼邑wttM3M狀干,邊（tt葉狀*撕聯(lián).獲卄耦犠,有出埒，卜邊豈WtlKfTJtt:板I盟糧狀.國(guó)屮，己題仆整咋.甲制 JtV*.ran點(diǎn)檢片芥萌代曲掃的若摘電碗國(guó)2.4.2 16S rDNA序列分析用引物27F和1492R對(duì)6株菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，均得到長(zhǎng)約為1.5kb的16S rDNA序列，將所獲序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)見(jiàn)表4。用BLAST程序

15、與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)Nil 2、Ni1 8、Ni2 5、Ni2 7、Ni3 1、Ni34 的16S rDNA 序列分別與 Arthrobactersp. 5118 (JX566636)、Arthrobacter sp. W1(EU339930)、 Alcaligenes faecalis TZQ4 (HQ14362 7.1)、Achromobacter sp. SR4(KC5 77545)、 Alcaligenes faecalis B_IV_2L10(JF710956.1)、Bacillus licheniformis CGMCC2 8 7 6 (GQ 1 4 8

16、 8 1 7.1 )的一致性均達(dá)98%以上(表4) 。利用MEGA5. 1軟件中基于Kimura2parameter 模型的Neig hbour joining (NJ)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。從圖3可知，6株菌株聚為4個(gè)類群，其中Ni 12和Ni 1 8與節(jié)桿菌屬 (A throbacter)的親緣關(guān)系較近，Ni34與芽抱桿菌屬(Eaci llus)的親緣關(guān)系較近，Ni2 7與無(wú)色桿菌屬 (Achromobac ter)的親緣關(guān)系較近，N12 5和N 13 1與產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcal igenes )的親緣關(guān)系較近。6性屏養(yǎng)硝址摘搖的同葬忡分析藺棵納-.建性0苛1-2Ek血z i Jf

17、k 51 IS99.4 rt/jjjLfhia iT-er 耳. VI JNiZ-!KJMI7IB*勒+1詢護(hù)曲町*r站1乂1閩鵡應(yīng)Amp*訪盤片RJ1 7H4占人“皿卜丁|*血皿心窟2J;U訴fg24#用即lmii i 仁鈉二3 小結(jié)與討論傳統(tǒng)氮循環(huán)理論認(rèn)為，執(zhí)行硝化作用的微生物是一群生長(zhǎng)緩慢的化能自養(yǎng)型 硝化細(xì)菌10。自1 949年Quastel等15以丙酮肟作為選擇 性培養(yǎng)基，首次分離獲得異養(yǎng)硝化菌株以來(lái)，異養(yǎng)硝化微生物和異養(yǎng)硝化作用引 起研究者們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與自養(yǎng)硝化細(xì)菌相比，雖然異養(yǎng)硝化細(xì)菌單 位菌體的硝化活性低，但其生長(zhǎng)速率快，在有大量有機(jī)物存在條件下，對(duì)氧氣和 營(yíng)養(yǎng)物的

18、競(jìng)爭(zhēng)比自養(yǎng)細(xì)菌強(qiáng)，容易成為優(yōu)勢(shì)菌，而且異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)高濃度氨氮 的耐受性強(qiáng)10，16，因此異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)污水中氨氮的凈化作用不可小 覷。.4円加宀乂w耳l 51 !8i)LAnttuE Uchriu/brwf CGMO： 2816(/1414117.1)Jbiid尸juriWix 17屮I Hijl加丄一氣 kjHillM-0.U2嚴(yán)蟲(chóng)岸心兒 l Il 21 in JI7H5*.I iT J塑”域林.t6S rfNA序艸的疾SE左育射本研究在富集培養(yǎng)異養(yǎng)硝化細(xì)菌時(shí)，用生長(zhǎng)曲線指導(dǎo)富集培養(yǎng)的時(shí)間，在對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)接，使自養(yǎng)硝化菌來(lái)不及充分生長(zhǎng)而快速被淘汰， 從而 增加分離異養(yǎng)硝化菌的

19、成功率。在初篩時(shí)，以鈉氏試劑為指示劑對(duì)氨氮進(jìn)行定性 檢測(cè)，在操作上簡(jiǎn)單快速，可大大提高篩選效率。目前報(bào)道的異養(yǎng)硝化細(xì)菌有糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis) 17、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutze ri) 18、惡臭假單胞菌(P. putida) 19、醋酸鈣不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter calcoaceticus) 1、枯草芽 抱桿菌(Bacillus subtilis) 20 、泛養(yǎng)硫球菌(Thi osphaera pantotropha) 21、球形節(jié)桿菌(Arth robacter globiformis) 22、脫氮畐寸球菌(Para co

20、ccus denitrificans) 23 等。通過(guò) 16S rDN A序列分析，本研究從1份環(huán)境樣品中篩選得到4個(gè)不同屬的高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌 共6株，結(jié)合菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、掃描電鏡觀察和16sDNA序列的比對(duì)分析，初步確定Ni 12和Ni 1 8為節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter) ,Ni2 5 和N i3 1為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，Ni2 7為無(wú)色桿菌屬(Achromobacter), Ni34為芽抱桿菌屬(Bacillus)，菌株的種類較為豐富。該結(jié)果可為高效異養(yǎng)硝化 菌的獲得及其多樣性分析提供參考。參考文獻(xiàn)：1 ZHAO B, HE Y L, HUGHES

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